外泌体调控成牙本质细胞炎性损伤修复的分子机制

Exosome is a kind of extracellular microvesicles, which plays an important role in intercellular communication. Our primary study had demonstrated that the inflamed odontoblasts not only take advantage of autophagic flux, but also increase the numbers of exosomes under the inflammatory stimulation. We proposed the hypothesis that the inflamed-odontoblast-derived exosomes (IOD-Exo) might participate in the survival of the injured odontoblasts and odontogenic differentiation of the dental pulp mesenchymal stem cells（DPMSC）. This project includes four parts. Firstly, we will detect and quantify exosomes from human caries and pulpitis samples compared with the counterparts. Secondly, we will establish in vitro co-culture system to confirm the biological role of IOD-Exo in the survival of odontoblasts and differentiation of DPMSC. The secretion and uptake of IOD-Exo will be tracing by time-lapse confocal microscope. Thirdly, we will identify the major enriched miRNA and protein of IOD-Exo which related to cell survival of odontoblasts and differentiation of DPMSC. MiRNA microarray and antibody array will be used following biological validation. Finally, we will investigate the role of IOD-Exo in the survival of injured odontoblast and odontogenic differentiation of DPMSC in vivo. Rab11a odontoblast conditional knock-out mice and experimental dental pulp injury model will be generated. In summary, the accomplishment of this project might help to elucidate the role of intercellular communication conducted by exosomes in inflamed odontoblast reparation.

外泌体是细胞主动释放介导细胞间物质与信息传递的囊泡状小体。申请者在上一个面上项目的支持下，发现炎性刺激下成牙本质细胞除了利用细胞内自噬机制参与损伤修复之外，还可增加外泌体释放。因此提出科学假说：“炎性成牙本质细胞来源的外泌体介导的细胞间信号传导在成牙本质细胞炎性损伤修复中发挥作用。” 本项目拟从以下方面开展工作：(1)明确炎性微环境中成牙本质细胞外泌体的分泌模式；(2) 利用共培养模型及外泌体示踪技术明确外泌体在炎性成牙本质细胞损伤修复中的作用；(3)利用中通量芯片筛选，生物信息学分析结合生物学验证，明确炎性微环境下成牙本质细胞源性外泌体中主要与成牙本质细胞生存及牙髓间充质干细胞成牙本质向分化相关的蛋白及miRNA；(4) 构建成牙本质细胞特异性外泌体分泌缺陷小鼠，探讨外泌体调控成牙本质细胞炎性损伤修复的体内机制。本项目的开展将进一步加深对炎性微环境中成牙本质细胞损伤修复分子机制的理解。

外泌体是由细胞分泌的一种胞外囊泡，在细胞间传递信息，参与多种生理病理过程的调控。本课题组研究发现外泌体参与了成牙本质细胞炎症损伤修复过程。为了明确“外泌体调控成牙本质细胞炎症损伤修复的分子机制”这一科学问题，分别通过以下几方面探究外泌体的作用及机制：（1）分别在人类标本、体外成牙本质细胞样细胞炎症损伤模型中分离、纯化、鉴定外泌体，明确了在炎性刺激下，成牙本质细胞可以释放外泌体; （2）利用体外构建的成牙本质细胞样细胞炎症损伤模型及牙髓间充质干细胞诱导分化模型，明确了成牙本质细胞源性外泌体可以被多种受体细胞内吞，对炎症微环境中的成牙本质细胞产生抗炎、抗凋亡作用，并可以通过促进牙髓间充质干细胞增殖、迁移、分化促进牙髓-牙本质复合体炎症损伤修复过程;（3）进一步通过miRNA芯片和生信分析等技术，筛选出了成牙本质细胞源性外泌体中抗炎关键因子hsa-miR-940和核心信号通路USP9X/NF-κB，利用双荧光素酶分析、western blotting等实验，揭示了成牙本质细胞源性外泌体可以通过hsa-miR-940/USP9X/NF-κB通路调控成牙本质细胞炎症反应的分子机制;（4）构建成牙本质细胞组织特异性Rab11a敲除鼠的牙髓损伤模型，观察炎症损伤中前期牙本质层、成牙本质细胞层的改变，体内验证了外泌体参与调控牙髓-牙本质复合体炎症损伤修复的作用。通过本项目的研究，加深了牙髓-牙本质复合体抵御炎症刺激的分子机制的认识。截止结题时发表第一或通讯作者SCI论文9篇，全部标注本项目资助，其中1篇发表于口腔领域权威期刊 Journal of Dental Research。参加IADR等国际会议3人次, 其中项目负责人在澳大利亚布里斯班第4届国际牙科研究协会亚太区分会（IADR-APR）上做题为“Odontoblastic Exosomes Attenuate Apoptosis in Neighboring Cells”大会报告，受到同行的高度评价。培养的博士生参加2019年中华口腔医学会口腔医学科研管理分会第四次学术年会，研究成果做题为“受损成牙本质细胞来源外泌体在抵御相邻细胞凋亡中的研究”汇报，获“明日之星”称号。