Snail启动子甲基化修饰在TGF-β1诱导腹膜间皮细胞EMT中的作用及黄芪干预研究

The epithelial-mesenchymal transition of peritoneal mesothelial cells (PMCs) is a crucial pathological process in early peritoneal fibrosis (PF). The nuclear transcription factor, Snail, is recognized as the regulator of EMT in tissue fibrosis. By regulating several signaling pathways, it could alter the biological characteristics of epithelial cells directly or indirectly, leading to EMT. DNA methylation is the important mechanism of epigenetics which effects on the regulation of EMT. Database analysis has revealed that the promoter of Snail contains CpG islands, which could be regulated by DNA methylation. Our previous study found Astragalus could inhibited EMT of PMCs by multi-targets. Besides, Astragalus decreased the Snail expression in TGF-β1-induced EMT. Its up-regulation role on DNA methyltransferase 1 (DNMT1) was observed in our pre-experiment, which reversed the TGF-β1-induced DNMT1 reduction. Based on the potential effect of Astragalus on Snail and DNA methylation, in this study, we intend to clarify the role of Snail and DNA methylation in EMT of PMCs, and expect to demonstrate its new molecular mechanisms in PMCs protection.

PMCs EMT是PD相关PF早期关键的病理学过程。研究表明核转录因子Snail是器官及组织纤维化EMT进程中重要的调控因子，其受多种信号通路调控，能直接或间接导致上皮细胞一系列生物学特性发生改变，引发EMT。而DNA甲基化作为表观遗传学重要机制之一参与EMT的整体调控。通过数据库分析，Snail启动子富含CpG岛，可以受到甲基化的调控。我们前期研究发现黄芪有多靶点协同发挥阻抑PMCs EMT的作用，并发现在黄芪抑制TGF-β1诱导的HPMCs EMT过程中，Snail表达下调。近期预实验结果显示，TGF-β1能够下调PMCs DNMT1，而黄芪有上调DNMT1的作用，提示甲基化转移酶（DNMTs）参与了黄芪抗PMCs EMT的机制。本研究拟借助动物、细胞模型，利用甲基化检测等分子生物学技术，首次阐明Snail与DNA甲基化修饰在PMCs EMT中的作用，揭示黄芪保护PMCs新的分子机制。

PMCs MMT是PD相关PF进程中的起始与可逆环节，我们前期研究已证实黄芪能作用于TGF-β1/Smads与Wnt/β-catenin信号转导间crosstalk，上调Smad7，竞争性抑制β-catenin的活性，促进β-catenin蛋白降解，阻断Wnt/β-catenin通路，阻抑PMCs MMT。然而，黄芪发挥多靶点调控的分子机制如何？研究表明，表观遗传学中重要内容DNA甲基化可能作用于MMT相关转录因子，参与PMCs MMT的整体调控。本研究第一部分以甲基化关键蛋白酶Dnmts为切入点，利用Dnmts特异性抑制剂5-aza、Dnmts siRNA基因转染技术，探讨Dnmts调节的DNA甲基化是否参与PMCs MMT及黄芪干预效果。第二部分采用BSP、BSAS、ChIP等甲基化实验手段检测Snail、E-cadherin是否作为甲基化修饰的基因靶点，黄芪能否调控其与Dnmts的结合水平，进而影响启动子甲基化。第三部分运用全基因组甲基化测序筛选黄芪调控的差异甲基化基因，验证ID2启动子与Dnmts的结合水平，是否作为黄芪调控PMCs MMT的甲基化关键修饰靶点。以KEGG富集分析为依据，探讨ID2如何通过PI3K/Akt信号调节TGF-β1/Smads通路阻抑PMCs MMT及黄芪作用效果。第四部分观察黄芪对大鼠腹膜病理改变、PMCs MMT及Dnmts蛋白的影响。结果：（1）Dnmts调节的DNA甲基化参与PMCs MMT病理进程；（2）黄芪能抑制Dnmts、PMCs MMT及其下游转录因子Snail；（3）Snail、E-cadherin并非黄芪直接调控的甲基化修饰基因；（4）全基因组甲基化测序探索黄芪调控的差异甲基化基因，分析获得ID2可能作为关键基因，受黄芪的去甲基化修饰，且黄芪能促进ID2基因转录和表达；（5）ID2启动子能与Dnmt3a结合，是PMCs MMT的甲基化关键修饰靶点，同时对PI3K/Akt与TGF-β1/Smads信号有抑制作用；（6）黄芪可能通过下调Dnmt3a参与DNA甲基化途径，发挥ID2启动子去甲基化作用，促进ID2基因转录及表达，进而介导Akt信号抑制TGF-β1/Smads通路，阻抑PMCs MMT。