分子显像无创监测MLC-2v为启动子的双基因重组腺病毒靶向治疗心肌缺血的实验研究

从基因水平探索心血管疾病有效治疗方法具有巨大的潜力和应用前景，而缺乏可靠的疗效监测方法限制了其发展。NIS报告基因无细胞毒性，而且成像简单，不需要复杂的探针和标记，因而更适合在心血管系统疾病中应用。心肌特异性肌凝蛋白轻链蛋白-2（MLC-2v，250bp）作为启动子可以提高VEGF在心肌细胞中特异性的表达。本实验选取250bp的启动子，将报告基因NIS与治疗基因VEGF偶联，制备重组腺病毒Ad-MLC-2v-NIS- MLC-2v-VEGF进行缺血心肌靶向性基因治疗与显像，探讨NIS基因作为报告基因，采用PET和SPECT显像，实时监测VEGF在活体动物缺血心脏中分布及表达的可行性。如证实其可行性，可将VEGF替换为其他各种需要研究的治疗基因（FGF, HGF, HIF-1等），并将NIS广泛应用于心肌缺血的实验以至临床应用中，有望解决目前心肌缺血基因治疗面临的缺乏有效的实时监测手段问题。

研究背景：从基因水平探索心血管疾病有效治疗方法具有巨大的潜力和应用前景，而缺乏可靠的疗效监测方法限制了其发展。NIS报告基因无细胞毒性，成像简单，更适合在心血管系统疾病中应用。心肌特异性肌凝蛋白轻链蛋白-2（MLC-2v）作为启动子可提高VEGF在心肌细胞中特异性的表达。本实验选取MLC-2v做启动子，将报告基因NIS与治疗基因VEGF偶联，进行缺血心肌靶向基因治疗与显像，探讨NIS作为报告基因实时监测VEGF在活体动物缺血心肌中分布及表达的可行性。主要内容：完成了质粒构建，病毒制备、纯化和鉴定，完成了体内外的实验。体外实验部分包括Western blot 检测NIS蛋白的表达，动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验。胎盼蓝染色检测病毒感染及NIS摄碘情况对心肌活力及增殖的影响。体内实验包括13N-Ammonia及99mTc-MIBI心肌灌注显像，18F-FDG心肌代谢显像，125I 报告基因动态显像。实验动物处死后行病理及免疫组化分析。实验结果：成功构建了以MLC-2v为启动子报告基因NIS与治疗基因VEGF偶联的双基因重组病毒。Western blot示MLC-2v为启动子重组病毒感染心肌细胞H9C2时，NIS与VEGF均有高表达，非心肌细胞表达较弱。以CMV或EF1a为启动子的病毒在心肌细胞中表达效率较MLC-2v组弱。动态摄碘实验感染Ad-MLC-2v-NIS的H9C2细胞高摄125I率是对照组细胞的10倍。H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制。体内实验部分13N-Ammonia、18F-FDG灌注与代谢显像有效评价实验小鼠心肌缺血与活力的情况，125I显像结果显示注射过重组慢病毒LV-mlc-VEGF-IRES-NIS的实验小鼠在心肌注射部位可见125I的放射性浓聚，对照组EF1a组表达低，生理盐水组无125I的放射性浓聚。免疫组化结果LV-mlc-VEGF-IRES-NIS组NIS，VEGF，CD34平均光密度值分别为3.32±0.36, 4.32±0.96, 2.75±0.15；生理盐水组为2.62±0.23, 2.88±0.40, 2.21±0.21。科学意义：证实NIS作为报告基因，实时监测VEGF在活体动物缺血心脏中表达的可行性，今后可将VEGF替换为其他治疗基因（FGF, HGF, HIF-1等），有望解决基因治疗面临的缺乏有效的实时监测手段问题。