利用基因组编辑技术TALEN研究FLT3-ITD突变导致AML进展的分子机制

FLT3-ITD mutation serves as a risk factor predicting relapse for AML patients. The sufficient and sustained activation of receptor tyrosine kinase induced by FLT3-ITD promotes the proliferation of leukemia cells and resists apoptosis. But most tyrosine kinase inhibitors demonstrate transient clinical activity with reduction of blasts in peripheral blood and cannot improve survival of AML patients. The screening of FLT3-ITD-related genes or pathways which promote leukemogenesis and accelerate leukemia progression has not only theoretical significance, but practical value. However, the characteristics of gene expression profiling from other concomitant genetic lesions will impede the screening of regulatory genes or pathways related to FLT3-ITD. Therefore, to reveal the differentially expressed genes derived from ITD mutation, we plan to establish engineered leukemia cell models by TALEN in FLT3 gene locus and subjecte to bioinformation analyses and validation of expression levels. When the candidate genes are selected, FLT3-ITD mutated cells will be transfected by lentivirus to induce or silence the expression of these genes, and in vitro (proliferation and apoptosis) and in vivo (NOD/SCID leukemia models) assays will be performed to demonstrate their correlations with FLT3-ITD, resolve the regulatory network and provide novel therapeutic targets.

FLT3-ITD突变是预测AML复发最重要的危险因素，能引起受体酪氨酸激酶显著而持久的活化，促进细胞增殖并抵抗凋亡。然而酪氨酸激酶抑制剂通常只能取得有限的血液学缓解，不能延长患者生存。因此，筛选FLT3-ITD突变促进白血病转化、加速疾病进展的关键基因或通路具有重要的理论和现实意义。然而FLT3-ITD突变常附加于其他具有表达谱特征的重现性遗传学异常，会对ITD突变相关基因或通路的筛选带来影响。因此，我们拟利用TALEN技术在白血病细胞株的FLT3基因区引入或修正ITD突变，结合生物信息学分析和表达水平验证筛选突变相关差异性表达基因；然后制备慢病毒在携带ITD突变的细胞模型中表达或沉默相应候选基因，通过增殖和凋亡检测，以及观察NOD/SCID小鼠模型的发病情况和生存期，说明这些基因或通路与FLT3-ITD突变的相关性，为解析该突变的的调控网络和分子机制，发展新的靶向治疗药物提供参考。

FLT3-ITD 突变是预测 AML 复发最重要的危险因素，能引起受体酪氨酸激酶显著而持久的活化，促进细胞增殖并抵抗凋亡。然而酪氨酸激酶抑制剂通常只能取得有限的血液学缓解，不能延长患者生存。因此，筛选 FLT3-ITD 突变促进白血病转化、加速疾病进展的关键基因或通路具有重要的理论和现实意义。我们利用TALEN技术建立了FLT3基因定点修饰细胞株，并发现敲入细胞株有明显抗凋亡、促增殖效应，符合FLT3-ITD过度自磷酸化后的生物学改变。我们进而将野生型和突变型分别送表达谱分析，初步发现FLT3-ITD敲入细胞Notch通路受抑而Wnt通路活化，并通过Western Blot和qRT-PCR证实了表达谱芯片的发现。为说明Notch通路受抑和Wnt通路活化与FLT3-ITD突变的相关性，我们在携带FLT3-ITD突变的AML细胞株（Molm13、MV-4-11）中加入不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂AC220，通过qRT-PCR检测Hes1和FZD4的表达，发现AC220能逆转Notch和Wnt通路的活化状态，且该药理作用呈浓度依赖性，说明在这两株ITD突变的细胞中，Notch通路受抑和Wnt通路活化是受FLT3-ITD磷酸化调控的。为说明Notch通路受抑与FLT3-ITD促增殖抗凋亡效应的关系，我们向Molm13和MV-4-11细胞转染慢病毒干预Notch通路活性，发现活化Notch通路能增加细胞凋亡，而抑制Notch通路能拮抗AC220引起的凋亡效应。这些数据表明：FLT3-ITD诱导的生物学效应至少部分是通过抑制Notch通路实现的。已知GSK3β是影响Wnt和Notch通路活性的节点，LiCl是GSK3β的抑制剂，初步结果表明1μM的LiCl能上调Molm-13和MV-4-11细胞Hey1的表达，提示在FLT3-ITD突变的AML细胞中，Notch通路的活性受GSK3β调控。综上所述，我们的研究发现FLT3-ITD 突变能通过磷酸化抑制GSK3β活性来调控Notch通路的活性，诱导细胞细胞增殖、拮抗凋亡，为靶向治疗携带FLT3-ITD突变的高危AML患者提供了潜在的新靶点。