靶向磷酸酶SHP-1治疗FLT3-ITD突变AML的机制研究

FLT3-ITD mutation may induce significant and lasting activation of receptor tyrosine kinase , which is an independent risk factor for refractory AML. However, current research on the negative regulation mechanism of abnomal signaling pathways of FLT3 is poor. It has been shown that tyrosine phosphatase SHP-1 participates in important negative regulatory function in myeloid cells.Our preliminary work suggests that FLT3-ITD interacts with SHP-1, and may affect the normal biological function of it.. Therefore, further study on the interaction mechanism between FLT3 and negative regulatory molecular SHP-1 may provide new ideas for finding potential therapeutic targets different from TKI. This project intend to explore the specific mechanisms and biological effects of interaction between FLT3 and SHP-1.Then, to explore the feasibility of designing FLT3 specific trans-membrane peptides as small molecular drugs targeting SHP-1 to reverse it's function. Thereby, to blocking the long lasting activated signaling of FLT3-ITD,and to provide a new targeted strategy for leukemia, especially those resistant to TKI.

在AML中，FLT3-ITD突变导致受体酪氨酸激酶显著而持久的活化，是其复发难治的独立危险因素。目前研究缺乏对FLT3异常信号通路的负向调控机制的阐明。研究显示，酪氨酸磷酸酶SHP-1在髓系细胞中参与重要负向调控功能。申请人前期工作提示，FLT3-ITD与SHP-1存在蛋白相互作用，且FLT3-ITD突变的AML中SHP-1的正常生物学功能可能被抑制。. 因此，进一步研究FLT3与负向调控分子SHP-1的相互作用机制，可能为寻找有别于TKI的潜在治疗靶点提供新的思路。本课题拟探索FLT3与SHP-1相互作用的具体机制及生物学效应。同时，探讨能否设计FLT3特异性穿膜肽作为小分子药物，靶向逆转SHP-1的功能，从而有效阻断FLT3-ITD下游信号通路的异常活化，为急性髓系白血病（尤其是TKI耐药者）的靶向治疗提供新的策略。

FLT3-ITD突变在急性髓系白血病(AML)患者治疗中仍然是一个巨大的挑战，因早期复发率高及酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)出现耐药突变。FLT3-ITD突变会导致下游信号通路显著且持续的激活，而这些异常激活通路的负向调控机制尚未阐明。本研究对白血病细胞株MV4-11进行免疫共沉淀(co-IP)和液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)进行筛选，发现磷酸酶SHP-1与FLT3结合。此外，通过co-IP和原位连接技术( PLA)在AML细胞系、原代样本和293-FT细胞过表达模型中验证SHP-1与FLT3-WT或FLT3-ITD的相互作用。我们发现在不同的细胞中SHP-1可以与p-FLT3结合并获得磷酸酶活性。反之，p-FLT3本身以及下游通路中的一些重要蛋白将被p-SHP-1去磷酸化，从而终止信号传递。利用慢病毒转染系统在FLT3-WT和FLT3-ITD细胞中过表达或敲除shp-1蛋白，实验表明在AML细胞中过表达shp-1可促进细胞凋亡、抑制增殖和克隆形成，尤其是在FLT3-ITD突变细胞中。反之，抑制shp-1则能促进增殖，提高细胞克隆形成能力。通过tet-on病毒系统获得dox诱导的SHP-1过表达细胞株，western blot结果显示SHP-1可能抑制p-ERK和p-STAT5活性。之后我们构建了截断和突变的质粒，发现FLT3与SHP-1的N-SH2结构域R30位点相互作用。研究人员通过特异的跨膜肽发现，它可以激活SHP-1，促进AML细胞的凋亡，尤其是FLT3-ITD细胞，抑制细胞增殖和FLT3的下游信号通路。最后，在裸鼠皮下肿瘤模型中注射肽，肿瘤明显小于对照组。综上所述，我们发现了一个负调控因子磷酸酶SHP-1，通过N-SH2结构域直接与FLT3受体相互作用，下调FLT3下游信号通路。过表达SHP-1可以促进FLT3-ITD突变细胞的凋亡和抑制增殖。通过人工跨膜肽激活SHP-1可以逆转FLT3相关的异常信号通路，从而为AML中靶向FLT3-ITD突变提供了一种新的潜在治疗策略。