带内标的血浆RASSF1A基因甲基化定量技术的建立

Hypermethylation in the promoter regions of tumour-suppressor genes is one of the early epigenetic events in human cancers. Our and other studies show that aberrant DNA methylation can also be found in the plasma of cancer patients. It is suggested that the quantitative detection of plasma DNA hypermethylation is a promising approach for the early screening, prognosis and monitoring of malignant tumors. However, the lack of sensitive and accurate quantitative methods hampers the clinical application of hypermethylated plasma DNA quantification. In this study, a novel hypermethylated internal standard will be designed to eliminate the variables introduced during DNA extraction, chemical modification and real-time PCR. A duplex real-time PCR assay with this internal standard will be developed as a novel method for accurate quantitative measurement of RASSF1A promoter hypermethylation in plasma and become a powerful tool for clinical utility of plasma DNA hypermethylation.

抑癌基因启动子甲基化是在人类多种恶性肿瘤组织细胞中经常发生的早期表观遗传学改变。文献报道和我们的研究工作均表明，在肿瘤患者血浆循环DNA中也存在抑癌基因启动子高甲基化改变，定量检测肿瘤患者血浆抑癌基因甲基化水平，对于肿瘤的早期诊断、预后判断和疗效监测，都有重要的临床意义。但是，由于缺乏灵敏准确的定量检测技术，血浆抑癌基因甲基化定量检测未能在临床开展应用。本研究拟设计一种新型的甲基化内部标准品，以消除核酸提取纯化、DNA化学修饰以及荧光定量PCR扩增中的偏差，并针对肺癌中甲基化率较高的RASSF1A基因，建立一种带有甲基化内标的双重实时荧光定量PCR技术，用于血浆RASSF1A基因甲基化的定量检测，该技术将有助于血浆DNA甲基化定量检测在恶性肿瘤实验室诊断中的临床应用。

恶性肿瘤患者血浆循环DNA中存在抑癌基因启动子高甲基化改变，定量检测肿瘤患者血浆抑癌基因甲基化水平，对于肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后判断，具有重要的临床意义和应用价值。然而，由于缺乏灵敏准确的定量检测技术，血浆抑癌基因甲基化定量检测始终未能在临床开展应用。. 本项目针对肺癌中甲基化率较高的RASSF1A基因，设计了一种新型的高甲基化内部标准品，该内标为线性双链DNA，长度为2,731 bp，与血浆DNA片段长度接近；含有一段来自RASSF1A基因启动子区的同源序列（39 bp）；其CpG的胞嘧啶通过转甲基修饰，与目的基因RASSF1A启动子区高甲基化状态一致。由于该内标与甲基化RASSF1A基因结构接近，在整个样本检测过程，特别是DNA化学修饰中能够保持同步；同时，我们还分别设计了针对RASSF1A基因和内标的荧光定量PCR引物与探针，其中两者使用同一条下游引物，均针对 RASSF1A基因启动子区的同源序列，且两者扩增条件一致，产物长度相近，保证双重荧光定量PCR中RASSF1A基因和内标的扩增效率接近。通过上述创新性设计，使内标能够起到良好的内参照作用，从而在最大程度上消除了核酸提取纯化、DNA化学修饰以及荧光定量PCR扩增中的定量检测偏差，保证定量结果的稳定可靠。. 通过方法学的评价与比较，该新型检测技术通过高甲基化内标的设立，可以发现由于前处理误差（核酸提取和化学修饰）导致的假阴性结果，从而提高了检测灵敏度（最低检测限10拷贝/ml），较传统外标法具有更宽的线性范围、更好的检测重复性和准确性。通过对89例肺部结节（性质不明）患者和23例健康对照的检测发现，内标法的甲基化阳性检出率高于外标法，内标法将诊断敏感性由外标法的43.1%提高到了58.6%；通过对 20例晚期非小细胞肺癌患者化疗前后血浆甲基化RASSF1A的动态监测发现，化疗后血浆 RASSF1A甲基化水平升高的11例患者中，90%的患者（10/11）提示良好的治疗效果，而9例甲基化降低的患者，78%的患者（7/9）治疗效果差；另外，甲基化升高的患者，其总体生存时间高于甲基化降低的患者。. 本项目建立的新型带高甲基化内标的血浆RASSF1A甲基化检测方法，是一个准确可靠的定量技术，有助于肺癌患者的早期诊断、疗效评价和预后判断，具有良好的临床应用前景。