利用连续重编程体系研究体细胞重编程的表观遗传机制

Differentiated somatic cells can be reprogrammed to induced pluripotent stem cells (iPSCs) through overexpression of defined transcription factors that are highly expressed in embryonic stem cells (ESCs). iPSCs hold great promise to be used for diseases modeling, drug screening and cell transplantation based regenerative medicine. Meanwhile, the fundamental molecular mechanism underlying reprogramming deserves to be unravelled. We have established two sequential reprogramming systems based on doxycycline inducible system. In the first system, we have produced inducible iPSCs using the traditional four transcription factors(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) and subsequently all-iPS mice were produced from these iPSCs through tetraploid complementation. At present, we have produced all-iPS mice to six generations. Furthermore, we have produced all-iPS mice in which the exogenous Oct4 was labeled with 3*Flag tag, which allows us to dissect the precise role of Oct4 in reprogramming. More recently, we have produced a second sequential reprogramming system in which the Oct4 was replaced by recently discovered DNA dioxygenase Tet1. In this specific project, we are planning to investigate the epigenetic mechanism of reprogramming involved in these two systems. DNA modifications, DNA damage and histone modifications will be investigated by using these two systems.

近来研究表明在分化的体细胞中过表达几个在胚胎干细胞中高表达的转录因子就可以将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞在再生医学领域具有巨大的应用前景，用来模拟疾病的发生，进行药物筛选，甚至可以用于细胞治疗。同时，iPS细胞也为我们提供了一个非常好的工具用来研究细胞命运改变的表观遗传机制。我们实验室近年来在iPS细胞领域获得了重要进展，我们已经利用Dox诱导系统建立了两类连续重编程体系，可以保证重编程起始细胞的均一性。在第一种连续重编程体系中我们用了传统的OSKM四因子，通过四倍体囊胚互补实验获得六代重编程iPS小鼠，另外，我们还建立了用3*Flag标记的Oct4制备的OSKM iPS细胞及小鼠，这样我们就可以非常精细的研究外源Oct4在重编程过程中的作用机制。我们近来的研究发现DNA羟甲基化酶Tet1可以替代Oct4完成重编程。我们将利用这两个体系研究重编程的表观遗传机制。

在本项目支持下，我们利用小鼠和人连续重编程体系，系统研究了终末分化体细胞重编程为诱导多能干细胞过程中的分子机制，揭示了重编程因子是如何通过改变表观遗传修饰进而调控基因表达的改变，从而达到将体细胞重编程为多能干细胞的分子机制。.首先，我们在实验室建立的OSKM可诱导iPS小鼠基础上，建立了连续六代重编程体系，揭示了在利用传统病毒方法介导体细胞重编程可能存在一定的风险，会造成突变的积累，提示我们将来iPS细胞在病人上的应用需要进行充分风险评估。进而利用这一独特的OSKM连续重编程体系探究了重要转录因子在体细胞重编程过程中的作用机制。以核心转录因子Oct4为例，我们发现在重编程的不同阶段，Oct4分层次地结合到基因组上，其结合受到了基因组上预先设置的表观遗传修饰的影响。转录因子和表观遗传修饰间相互关联和互作，共同调控细胞内基因表达的变化，最终导致细胞命运转变。Oct4的结合对于重编程过程中多能网络的层次性有序激活具有重要作用。其次，我们利用OSKM连续重编程系统系统研究了由内中外三胚层来源的体细胞重编程为具有很好多能性的iPS细胞中核小体组装情况。发现这些细胞系的基因表达谱有高度相似。具有真正多能性干细胞（iPSC与ESC）之间全基因组的核小体占有（occupancy）也是高度相似，但多能性细胞与小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）之间全基因组的核小体占有呈现显著差别。这个结果也表明重编程过程中核小体分布被精确重塑，从而与转录因子形成各自独特的空间关系，达到精确调控基因转录表达，从而维持细胞多能性。在对雌性体细胞重编程机制研究中，我们发现在重编程过程的前期抑制Xist的表达会阻碍间充质细胞向上皮细胞转换的过程，然而，在重编程过程的后期抑制Xist的表达会极大地促进雌性前体诱导多能性干细胞向诱导多能性干细胞的转换，对其中的分子机制也进行了阐述。我们还对Tet1介导的体细胞重编程机制进行了研究。相关研究成果发表在Nature, Nature Communications, Cell Reports, Stem Cells等国际知名学术期刊上，提升了我国在该领域的影响力。