拟南芥基因组重组热点的高分辨率作图研究

Meiosis is a special reductional cell division during which homologous chromosome pairing, synapsis and genetic recombination are achieved. Meiotic recombination is the main source of genetic variation in sexually reproducing organisms, it speeds adaptation, and laid the foundation for traditional plant breeding. The recombination events predominantly occur at discrete genomic loci called recombination hotspots. The distribution of recombination hotspots in plant genome and the features defining these areas are still largely unknown. To understand the distribution of recombination events in the Arabidopsis genome, the proposal will map the distribution of meiotic double-strand breaks (DSBs) that initiate meiotic recombination, and chromosome crossovers (COs), one of the main results of recombination, with a novel chromation immunoprecipitation-sequencing approach, using antibody of the DSB or CO-binding proteins. The chromosome structures, the local genome features and the specific DNA core sequences of DSB hotspots will be identified. Factors that govern the distribution of hotspots will be experimentally analyzed based on mutant and localization studies. This study will not only map and analysis Arabidopsis recombination hotspots with novel and high-efficiency approaches, but also provide insights into the distribution and formation of Arabidopsis recombination hotspots.

减数分裂过程中，同源染色体配对并进行遗传物质的交换重组，这是形成遗传多样性的来源和植物育种的遗传基础。重组在基因组中并非随机分布，存在重组的热点。目前，植物重组热点的分布模式在很大程度上是未知的，已成为认识和利用这一现象的瓶颈。本项目拟基于ChIP-SEQ技术构建完整的拟南芥基因组重组热点图谱，利用图谱分析重组热点的早期决定因子。我们拟在减数分裂细胞中特异性地富集与重组断点结合的蛋白，纯化并检测断点DNA，利用深度测序数据对重组的位置和频率进行全基因组精确定位和统计，构建重组早期DNA双链断裂和晚期染色体交换的高分辨率热点图谱，了解其分布模式。在此基础上，通过突变体和染色体定位分析，了解重组热点相关因子的功能，筛选鉴定参与重组热点决定的功能基因或标记。本研究不仅引入新的、高效率的技术路线来构建研究拟南芥重组热点图谱，而且对于拟南芥重组热点形成条件的了解具有重要意义。

减数分裂重组是高等真核生物遗传变异的重要来源，重组发生的位置在染色体上不是均匀分布的，存在重组热点与冷点。重组热点的分布与形成机制是生命科学领域备受关注的重要课题。本研究通过测定RAD51和MLH1在减数分裂时期染色体上的位置了解基因组重组位置的分布。首先构建了RAD51p::TY1-RAD51-HA表达载体，利用农杆菌介导转化rad51突变体。然后构建了MLH1p::TY1-MLH1-HA表达载体，导入mlh1突变体背景中。转基因分别恢复了rad51和mlh1突变体不育的表型，说明融合蛋白表达载体功能正常。收集减数分裂时期细胞，利用HA标签抗体识别结合RAD51与MLH1，富集结合DNA片段，通过ChIP-SEQ构建拟南芥重组热点图谱。与小鼠和玉米相比，拟南芥DSB热点在染色体中分布较均匀，类似玉米的情况，这可能与植物中不含PRDM9有关；与玉米不同的是，拟南芥着丝粒区域的DSB数量明显变少。与玉米相比，拟南芥CO频率在全染色体范围内变化幅度较小。2号染色体上臂靠近着丝粒区域既是DSB热点区域，也是CO频率较高的区域，且着丝粒区域CO频率较低，因此DSB频率可影响CO频率。通过分析减数分裂细胞测序数据，挑选了9个在减数分裂细胞中相对花药壁或植株整体表达量上调的基因，其中包括5个RNA解旋酶编码基因。收集购买其突变体，从育性变异为线索筛选分离减数分裂重组功能基因。筛选得到两个编码RNA解旋酶的育性相关基因RH032和RH034。rh032突变体存在育性下降、发育迟缓等多重缺陷。rh032突变体对DNA修复抑制剂CDDP和MMC处理更敏感，暗示RH032参与修复DNA损伤修复。为研究其在减数分裂重组中的功能，将突变体与引入花粉不能解聚的qrt1-2突变体且含荧光花粉的背景中，利用荧光花粉统计重组频率。在统计的两个遗传间隔I5c和I5d中，rh032突变体的遗传距离显著高于WT，即rh032突变增加了重组频率，RH032是重组的抑制因子。RH034的强突变体雌配子败育，敲低表达植株类似rh032突变体。该研究获得了较全面的拟南芥高分辨率重组图谱，建立的技术体系为研究候选基因在重组频率调控中的功能奠定了技术基础；发现了新的调控重组的RNA解旋酶。