CHD3表达促进人胚胎干细胞向血管内皮细胞定向分化的机制研究

Angiogenesis plays very important roles physiologically and pathologically in both cardiovascular diseases and tumorigenesis. However, the detailed molecular mechanism is still unclear because of its complexity. Directional differentiation from human embryonic stem cells (hESCs) to endothelial cells (ECs) could be a useful cell model for investigation of angiogenesis. Our previous study revealed that overexpression of FLI1, as well as activation of protein kinase C (PKC) simultaneously, could rapidly and evenly differentiate more than 90% hESCs to endothelial progenitor-like cells (iECs) in only 3 days. Further investigation showed that CHD3, a member of CHD superfamily, is significantly upregulated during the induction. Knockdown of CHD3 dramatically decreases the differentiation efficiency, which implies that CHD3 plays an important role in EC differentiation, while the mechanism is far from clear. In this project, we will firstly elucidate the effect of CHD3 to hESC-EC differentiation in two induction systems (including our newly established system) by knockdown/knockout approach. Moreover, the downstream signaling pathway and interacting proteins will be identified by combining the multi-omics data including RNAseq, CHIP-Seq, and mass spectrum followed CHIP. Finally, we will establish knockout mice model to verify the function of CHD3 in angiogenesis. Hopefully, our project will offer a new angle for the mechanism of angiogenesis.

血管再生在心血管病和肿瘤中有重要的生理和病理意义。然而其机制十分复杂，目前仍不十分清楚。人胚胎干细胞(hESC)向血管内皮细胞(EC)定向分化可作为研究血管再生的重要模型。我们前期研究发现在hESC中过表达FLI1同时激活蛋白激酶C可以在3天内将90%以上的hESC定向诱导为EC。进一步研究发现CHD家族中的CHD3在这一过程中呈现高表达。敲减CHD3可以明显降低hESC向EC的分化效率。说明CHD3在EC分化中起重要作用,但其机制不明。本研究拟通过敲减/敲除CHD3明确在两种诱导体系中对hESC-EC定向分化表型的具体影响，进而通过将转录组、CHIP-seq、免疫共沉淀质谱等数据综合分析探索其下游信号通路及相互作用蛋白，最后通过基因敲除小鼠模型验证CHD3对小鼠血管再生的影响。该项目的实施有望为血管再生的机制提供新研究思路。

项目组在对CHD3表达促进人胚胎干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究中发现，经典的细胞因子VEGF以及PKC及其亚基在hESC-EC诱导中发挥重要作用且存在互为激活的正反馈关系，通过利用PKC激活剂、抑制剂和PKC各种不同亚型的siRNA，对不同条件下hESCs向EC定向诱导的效率、EC特异性表面标记及基因表达情况等进行观察，发现在hESC-EC诱导过程中VEGF可以部分替代PKC的作用，这个作用主要是通过PKC尤其是PKCε和PKCη发挥的。通过构建基因敲除小鼠，探究了cXorf36基因对内皮细胞发育的影响以及cXorf36调控自噬的潜在机制，利用免疫荧光及流式检测敲除细胞系与野生细胞系向内皮细胞诱导效率，结果显示二者并无明显差异，利用qPCR对诱导过程中多能性基因以及内皮形成基因进行了检测，敲除与野生型的细胞系也无明显区别，说明该基因在新型诱导过程中的上调与内皮细胞自然分化形成无直接联系。通过免疫荧光发现该基因与高尔基体以及溶酶体有明显的共定位关系，提示该基因与自噬存在一定联系，该基因过表达可能会使自噬反应加强。利用本课题组之前建立的高效hESC-EC诱导(FLI1-PKC)系统，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究了hESC-EC的转录景观和细胞动力学，发现激活转录因子数量的增加是FLI1-PKC系统比其他hES-EC方案更有效的原因。我们建立了微量细胞基因组稳定性检测技术储备，该平台提供了一种高精度的检测拷贝数变异的三倍体、杂合性丧失、平衡易位和亲本起源的方法。建立了线粒体拷贝数检测的技术储备，利用该技术我们研究发现卵丘颗粒细胞线粒体DNA拷贝数可能与卵母细胞质成熟度有关。我们还建立了一个从卵泡液中代谢组的特征来评估胚胎和卵母细胞质量的模型，发现卵泡液中磷脂酰胆碱的增加意味着胚胎质量在第3天下降，因此在临床上可以通过代谢组学评估胚胎或卵母细胞质量。