ADSCs向血管内皮细胞定向分化的分子机制研究

Vascular endothelial cells (VEC) transplantation is an effective cell therapy for various ischemic diseases. However, the insufficient source of VEC has seriously affected its research and application in clinical treatment. At present, although the researchers have made some progress in understanding the differentiation mechanism of VEC, there remains a shortage of robust methods for generating lineage-specific VEC from pluripotent and adult stem/progenitor cells. When we screened the methods of directional differentiation of human adipose mesenchymal stem cells (ADSCs) to VEC, we found that increasing the expression of K protein in ADSCs can significantly improve the differentiation efficiency of ADSCs to VEC, and the inhibitor of TGF-beta signaling pathway has synergistic effect with it. In this work, we will reconstruct the differentiation trajectory of VEC in vitro, clarify the molecular regulation mechanism of VEC differentiation of K protein and its related signaling pathways, and the interaction between K protein and TGF-beta signaling pathway using in vitro cell isolation and culture technology, directional differentiation induction technology of stem cells, flow cytometry, single cell sequencing technology and bioinformatics analysis technology. On this basis, we will further optimize the induction scheme of ADSCs differentiating into VEC, as well as the survival, maintenance and expansion scheme of induced cells, establish a standardized process of directed differentiation of VEC widely applicable to various stem cells, and provide a large number of functional VEC-like cells for the treatment of ischemic diseases.

血管内皮细胞(VEC)移植是缺血性疾病治疗的一种有效疗法。然而，VEC来源不足严重影响了其在临床治疗中的研究和应用。尽管人们对VEC分化机制的认识有所进展，但仍缺乏从干细胞中获得VEC的有效方法。我们在筛选人脂肪间充质干细胞（ADSCs）诱导分化方案时发现，上调ADSCs中K蛋白的表达水平可显著提高其向VEC的分化效率，且TGF-β信号通路抑制剂与K蛋白具有协同作用。本课题将综合利用细胞分离培养、干细胞诱导分化、流式细胞分选、单细胞转录组测序及生物信息学分析等技术，体外重建VEC的分化轨迹，明确K蛋白对ADSCs向VEC定向分化的分子调控机制，及其与TGF-β信号通路的相互作用；并在此基础上，进一步优化ADSCs向VEC定向分化的诱导方案，以及诱导细胞的存活维持与扩增方案，建立一种广泛适用于多种干细胞的VEC定向分化标准化诱导流程；为缺血性疾病治疗提供大量有功能的类VEC细胞。

脂肪间充质干细胞（ADSCs）是一种存在于脂肪组织中的干细胞，含量丰富，容易获取。ADSCs具有较强的可塑性，可分化为3个胚层来源的多种细胞，且ADSCs可作为再生通路的“激活剂”，而不是简单的替代受损细胞。血管内皮细胞（VEC）移植是缺血性疾病治疗的一种有效疗法。但VEC来源不足影响了其在临床治疗中的研究和应用。尽管人们对VEC分化机制的认识有所进展，但仍缺乏从干细胞中获得VEC的有效方法。本项目首先从干细胞诱导分化方向对ADSCs促血管再生的生物学功能及机制进行了探讨，建立了一种ADSCs向VEC定向分化的标准化诱导流程。我们发现ADSCs细胞群体中约有66%处于谱系预备状态，包括成脂、成骨、成软骨、成血管和成神经等谱系的定向前体细胞，且其中约39%的细胞处于多重谱系预备状态。此外，我们通过基因差异表达分析筛选某一个处于谱系预备状态细胞的特异性表面标记时发现，某些基因只在一个谱系中显著上调，而在其他谱系中显著下调或没有显著变化，提示这些基因在细胞分化方向决定中具有重要作用。由ADSCs定向诱导分化获得的VEC具有成熟血管内皮细胞的典型特征：特异性表达vWF，可摄取ac-LDL及分泌EGF、VEGF等细胞因子，并具备体内、体外成管能力，且无成瘤性；有望为缺血性疾病的细胞治疗提供大量有功能的类VEC细胞。此外，我们关注到在成年个体中，生理条件下ADSCs极少向脂肪细胞分化，但在一些病变组织微环境的调控下，ADSCs能逐步分化为成熟脂肪细胞，如淋巴水肿患者病变组织中的ADSCs促血管生成能力减弱，而成脂分化能力增强。故本项目在完成既定任务的情况下，在单细胞⽔平探讨了脂肪组织血管基质组分中ADSCs与巨噬细胞在肿瘤相关继发性淋巴水肿中的病理生理机制，筛选出了可用于继发性淋巴水肿治疗的潜在靶点。本项目与国家自然科学基金“十四五”发展规划中的重点支持方向—“细胞命运可塑性与器官发生、衰老、再生和再造”密切相关，具有充分的可持续研究价值，以及较高的社会和经济价值。