西瓜枯萎菌人工miRNAs基因沉默技术构建及致病相关基因鉴定分析

Fusarium wilt of water-melon caused by F. oxysporum f. sp. niveum(E.F. Smith) Snyder &Hansen (Fon) is one of the most severe diseases in watermelon and is also one of the major limiting factors for watermelon production in the world. Recent studies have shown that the expression of silencing constructs in plants designed on fungal genes can specifically silence their targets in invading pathogenic fungi, such as Fusarium verticillioides, Blumeria graminisand Puccinia striiformis f.sp. tritici.We address important aspects for the development of fungal-derived resistance through the expression of silencing constructs in host plants as a powerful strategy to control fungal disease. The artificial microRNA (amiRNA) technology exploits endogenous miRNA precursors to generate sRNAs that direct gene silencing in either plants or animals. Although the plant microRNAs-like small RNAs existed in fungi, the artificial microRNAs technique is not established till now. Consequently, we have study the small RNA expression profile of Fon with illumina deep sequencing plantform, and have proved that the small RNA precursor of Fon could generate the mature miRNA by PEG-mediated transformation. This study was aim to construct the artificial miRNAs platform according to the principle and method of plant miRNAs, and verify the pathogenicity-relative candidate gene in the T-DNA insertional library of Fon using the gene silencing technique. Results of the study would provide the target gene for for the HIGS that has potential for culture the resistance cultivars.

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种世界范围内的真菌性土传病害。有文献表明，通过基因诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）在寄主中表达RNAi沉默载体是培育抗病原真菌的新品系的有效措施。 microRNAs是一类真核生物广泛存在的重要基因表达调控因子。目前，依据microRNAs骨架序列构建的人工miRNAs基技术广泛应用在植物功能基因分析中。真菌中虽然存在与植物microRNA类似的小RNA，但目前还未建立人工miRNAs技术。课题组前期测定了西瓜枯萎菌小RNA表达谱，初步试验表明，PEG介导的原生质体转化小RNA骨架序列可以体内加工成为成熟的小RNA。 本项目模仿植物人工miRNAs的原理和方法，构建尖镰孢西瓜转化型的人工miRNAs基因沉默技术，并验证西瓜枯萎菌突变体库中的候选致病相关基因功能，为后续采用HIGS培育抗性品系提供理论依据。

真菌中虽然存在与植物 microRNA 类似的小 RNA（microRNA-like，milRNA），在病原真菌的致病性中发挥重要作用，但目前还未建立有效的真菌milRNAs功能鉴定和分析技术。因此，本项目拟模仿植物人工 miRNAs 的原理和方法，试图构建病原真菌的人工 miRNAs技术。项目以病原真菌内源小RNA前体序列为基础，分别采用本生烟瞬时表达、原生质体转化分析都证实真菌的milRNAs可以正确加工并表达人工设计的小RNA序列，因此，真菌的milRNAs与植物miRNA具有相同结构特征适合构建人工milRNAs，并依据表达水平以及结构特征选择milR2构建人工milRNAs。WMD3网站设计特定靶标基因人工小RNA序列后overlap PCR替换milR2骨架序列构建人工milRNA序列，导入到改良的pCT74载体上构建人工milRNAs表达载体。. 为了验证构建人工milRNAs基因沉默技术的可行性，首先以携带GFP报告基因的菌株为实验材料，实验证实真菌的人工milRNAs既可以沉默mRNA也可以沉默小RNA，然后，分别以病原菌PDA培养基上测序获得的内源小RNAs、以及侵染过程中产生的致病相关小RNAs为靶标，原生质体转化后获得的转化子的表型以及致病力都发生了显著的变化。这些结果一方面说明我们构建的人工milRNAs技术体系可以特异的沉默病原真菌的小RNA，方便后续的功能分析；另外一方面也说明这些小RNA在病原菌的生长以及致病性方面发挥重要作用。. 感谢基金委对本项目的支持，目前已经发表SCI论文5篇，中文核心期刊1篇，核心数据以及部分实验仍然没有发表，后续将继续发表相关的论文。在这个工作基础上，获得了2015年度国家自然科学基金面上项目资助（31571957）以及2016年国际(地区)合作与交流项目（NSFC-CGIAR项目）。