西瓜枯萎病菌致病相关基因克隆与功能分析

Fusarium oxysporum f. sp. niveum is a worldwide soil-borne disese which causes a highly destructive wilt disease in watermelon (Citrullus lanatus). HaiNan is one of the most important winter-spring watermelon production bases in China. It is of great significance to understand the molecular mechanism of pathogenicity for improving the efficiency of resistance breeding and integrated management. In this study, we will firstly generate a T-DNA insertional library of F. oxysporum f. sp. niveum Fon1 with Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The infection deficient mutants will be screened out from this T-DNA insertional library and T-DNA flanking sequences will be amplified by TAIL-PCR or inverse PCR. The candidate genes will be identified by gene knockout or over-expression. Results from this study will elucidate the molecular mechanism of the pathogenicity in F. oxysporum f. sp. niveum and provide candidate genes suitable for generating transgenic plants with improved F. oxysporum resistance.

西瓜枯萎病为西瓜生产中危害最为严重的一种世界性土传病害。海南是我国主要冬春季商品西瓜生产基地之一，西瓜枯萎病菌的危害严重阻碍了海南西瓜种植产业的发展。揭示该尽菌的致病分子机理对于提高抗病育种效率和综合防控效果具有重要意义。本项目拟以尖孢镰刀菌西瓜转化型1号生理小种Fon1为材料，利用农杆菌介导转化技术，构建西瓜枯萎病菌T-DNA插入突变体库，然后从突变体库中筛选致病力缺陷型菌株，利用TAIL-PCR、反向PCR等克隆T-DNA插入侧翼基因组序列，对筛选到的候选基因进行功能分析，鉴定出西瓜枯萎病菌致病相关基因。研究结果将会阐明西瓜枯萎病菌侵染致病的分子机理，也为西瓜等瓜类作物转基因抗尖孢镰刀菌提供候选基因。

西瓜枯萎病为西瓜生产中危害最为严重的一种世界性土传病害。揭示该尽菌的致病分子机理对于提高抗病育种效率和综合防控效果具有重要意义。本项目主要研究内容为：1、以尖孢镰刀菌西瓜转化型1号生理小种Fon1为材料，构建西瓜枯萎病菌T-DNA插入突变体库。筛选致病力缺陷型菌株，鉴定出西瓜枯萎病菌致病相关基因。2、研究Fon1中miRNA合成通路相关基因AGO和DCL。分别将AGO1，AGO2以及DCL1，DCL2进行基因敲除，并测定其相关的生物学特性研究、致病力。3、AGO、DCL敲除突变体进行小RNA测序。进行7个样品的small RNA测序，获得新预测miRNA，获得差异表达miRNA，并预测其miRNA靶基因，完成对差异表达miRNA靶基因的功能注释和富集分析。主要研究结果如下：1、构建了总数为3832个转化子的突变体库，并对其进行了质量评价，从2201个转化子中筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个；2、获得AGO、DCL敲除突变体，AGO1单敲和AGO1/2双敲除转化子生长速度略微快于野生菌株Fon1，AGO2单敲和DCL1、DCL2、DCL1/2敲除转化子生长速度与野生菌株Fon1无差异。野生菌株Fon1与AGO，DCL敲除转化子的产量能力无显著差别。在细胞壁完整性胁迫因子CR和CFW处理下，AGO、DCL单双敲除转化子较为敏感。囊泡转运抑制剂、渗透压、氧化胁迫和金属离子等胁迫因子，AGO、DCL单、双敲除突变体与野生菌株无显著差异。通过统计其发病植株及病死株，AGO1敲除转化子发病植株少于野生株，发病轻于野生菌株；而AGO2敲除转化子病死株高于野生株，发病较重；AGO1/2双敲除转化子致病力与野生菌株无显著差别。在DCL敲除突变体方面，DCL2敲除转化子致病力弱于野生菌株，而DCL1突变体强于野生菌株，双敲转化子无显著差别。3、完成了7 个样品的small RNA测序，共得到 164.40 M Clean Reads，各样品不少于 12.86 M Clean Reads。新预测miRNA 99个，定量各样品miRNA表达丰度，获得差异表达miRNA。预测到miRNA靶基因81个，并完成对差异表达miRNA靶基因的功能注释和富集分析。研究结果将会阐明西瓜枯萎病菌侵染致病的分子机理，也为西瓜等瓜类作物转基因抗尖孢镰刀菌提供候选基因。