DNMT1通过与RNA聚合酶polII相互作用而导致抑癌基因启动子区域异常甲基化的机制研究

The inactivation of tumor suppressor gene (TSG) is closely associated with tumor incidence and development. Abbarrent methylation at promoter regions is one of important ways for TSG inactivation in many types of tumor. However, the underlying mechanism remains elusive. Our previous studies indicate there exist direct interaction between DNMT1 and RNA polymerase polII and these two proteins are co-precipitated in immuno-precipitation experiments. Moreover, the binding regions on chromosomes of these two proteins are mostly overlapped. Based on these observations, we propose that DNMT1 is brought to gene promoters by interacting with polII and lead to the aberrant promoter methylation of TSG with the assistance of other carcinogenic factors. Here, we will first determine the protein domain necessary for their binding, and mutate such domain in polII. Then, we will transfect mutated and wild type polII　genes into cells repectively and investigate promoter methylation alterations under carcinogenic conditions. Finally, BS-seq and ChIP-seq will be employed to reveal the changes of DNA methylation, as well as DNMT1 and polII binding, within the whole genome. We will also try to screen drugs that can specifically suppress abbarrent methylation at TSG promoters via blocking the interaction between DNMT1 and polII. This project will illucidate the epigenetic mechanims leading to TSG inactivation, and guide the development of new anti-tumor drugs.

抑癌基因的失活与肿瘤的发生发展密切相关。启动子区域异常甲基化是多种肿瘤抑癌基因失活的重要方式，但这种异常甲基化的形成机制一直不清楚。DNMT1是重要的DNA甲基化酶。我们前期的研究表明该酶与RNA聚合酶polII存在直接相互作用，且两者在染色体上的结合位点有很大程度的重叠。polII的主要功能之一是识别并结合基因的启动子。据此本项目提出假说，认为DNMT1通过与polII结合作用于抑癌基因启动子区域，从而导致其异常甲基化。本项目拟确定polII与DNMT1直接结合的蛋白结构域；将该结构域定点突变后，观察在致癌条件下抑癌基因启动子区域甲基化的动态变化；运用深度测序技术，对该变化在全基因组内进行分析，以验证我们的假说。最后我们还尝试筛选能够通过特异阻断DNMT1与polII结合而抑制抑癌基因启动子异常甲基化的药物。本项目能够揭示抑癌基因失活的表观调控机制，为抗肿瘤药物的开发提供新的理论依据。

抑癌基因的失活与肿瘤的发生发展密切相关。启动子区域异常甲基化是多种肿瘤抑癌基因失活的重要方式,但这种异常甲基化的形成机制一直不清楚。利用甲基化测序数据寻找参与调控基因启动子区域异常甲基化的相关基因是研究甲基化形成机制的一种重要方式。寻找差异甲基化区域（Differential Methylation Region, DMR）是分析甲基化组测序数据的一种重要方法，DMR的精确定位是进行数据分析非常重要的前提。我们开发了一种应用局部Getis-ord统计量来寻找DMR的算法—GetisDMR，该算法可用于分析肿瘤基因组甲基化测序数据。该算法与以往寻找DMR的方法相比，在sensitive及positive predictive value上有优势，而且DMR的位置更准确，且该算法找到的DMR区域生物学意义明显。我们用GetisDMR方法寻找乳腺癌细胞HCC1954与正常乳腺上皮细胞HMEC之间在基因启动子区域的甲基化差异，发现有一半左右的差异DNA甲基化区域属于弱增强子或强增强子。此外，我们分析了34种人类组织和16种小鼠组织的甲基化数据，并提出互补指数(Complementary Index, CI)的概念，用非线性模型模拟了CpG密度与DNA甲基化水平的负相关性。同时，基于DNA甲基化和CpG密度之间的互补规律我们提出了一种新的基因组划分算法 (CGPA)，该算法将基因组分成4种区域，分别是：COG (Conflicts of Gap)区域，COO (Conflicts of Overlap)区域，HMV (Harmony with Medium Values)区域和HEV (Harmony with Extreme Values)区域。使用CGPA算法得到的区域与之前报道过的甲基化组织差异性区域相比，组织聚类效果更明显。同时，我们发现tpCOG区域参与了对启动子激活的选择性调控；tdCOG区域具有调控组件的特征，而且调控组织功能相关的重要基因的表达。此外，我们找到了一种通过allele frequency来推断肿瘤克隆进化的方法，这将有助于我们应用肿瘤突变克隆进化的分析方法来阐明肿瘤发生发展过程中遗传学改变与表观遗传学改变的相互影响。