基于靶向基因组分子条形码测序策略检测环境所致遗传学损害的研究

Environmental pollutants have the potential to damage genetic material DNA, and eventually lead to cancer incidence. Currently the technique is still unavailable to detect genetic damages at genome scale and base resolution. The applicant has accumulated plenty of experiences in the fields of environmental biology, genomics and next-generation sequencing. In the pilot studies we developed the target-genome molecular-barcoding sequencing (TMA) assay, and compared its performance with the canonical genetic toxicity test, Ames assay, and found TMA assay could detect the mutational spectra in ENU-treated Salmonella typhimurium. In this project, we will determine the environmental factor-susceptible genome regions, improve the efficacy of constructing molecularly barcoded sequencing library from various sources of DNA, evaluate its sensitivity and accuracy in bacteria, in-vitro cultured cells, animals, and human peripheral blood, select the individuals or population who were long term exposed to environmental pollutants for genetic damage detection, and demonstrate the mechanisms by which environmental pollutants exert their genetic damages. This project will provide technical supports for the detection of environmental pollutants-induced genetic damages.

环境因素可导致基因损伤变异并诱发癌症，而在基因组范围且单碱基水平检测环境所致遗传学损伤的关键技术尚缺。申请人在环境生物学(Environ. Mol. Mutagen. 2011)、基因组学(Genome Biol. 2015)、二代测序(Bioinformatics 2016)领域较有积累。前期我们开发了靶向基因组分子条形码测序技术，该技术优于经典遗传毒理学检测方法Ames assay，能精准检测到化合物ENU所致的鼠伤寒沙门氏菌基因突变图谱梯度。本项目中，我们将确定环境因素特异的靶向基因组区域；提高不同来源DNA的分子条形码测序文库构建效率；在原核生物、体外培养细胞、动物及人体等几个不同层次确定该技术的灵敏度与准确性；选取长期暴露于环境污染物的个体及群体开展实地检测；建立可用于人体标本检测的规范流程；并阐明环境因素发挥遗传学毒性的机制。该项目将为环境因素所致基因损伤的检测提供技术保障。

环境因素可导致基因损伤变异并诱发癌症，因此癌症的发生是突变逐渐积累的动态过程。因此监控癌症发生前或癌症早期的低频体细胞变异具有重要的诊断价值。但是，目前仍缺乏能在基因组范围且单碱基水平检测稀有DNA变异的关键技术。本项目中我们进一步优化了靶向基因组分子条形码测序技术方法的参数。从开源数据集分析获得了常见突变位点用于靶向扩增引物的设计。通过建立标准采样流程并调整各种建库条件，进一步降低了人外周血白细胞基因组DNA或细胞游离DNA（cfDNA）建库起始用量，实现了DNA稀有突变的高效检测，证明了利用靶向基因组分子条形码技术在人体样本中检测遗传变异的可行性。胆管癌解剖位置特殊且肿瘤体积较小，获取肿瘤组织非常困难，加上胆管癌肿瘤异质性特征明显，导致临床诊断准确率较低且手术效果评估困难。因此，开发具有诊断和疗效评估价值的生物标志物或检测手段尤为重要。应用靶向基因组分子条形码技术，我们在疑似胆管癌患者外周血cfDNA发现了很多癌症患者中也存在的变异位点，说明炎症在进展到癌症的前期阶段已经累计了一定数量的变异，可通过检测cfDNA变异来辅助癌症的早期诊断。受试者工作特征曲线对比分析结果表明患者外周血cfDNA变异数量对癌症和疑似症状患者的分组效果优于常用肿瘤标志物。此外，通过比较患者手术前后的cfDNA变异的等位基因频率偏差值差异，发现cfDNA变异的检测可用于监控手术疗效。以上研究结果使我们加深了对人体稀有体细胞变异的认识，同时有助于推动靶向基因组分子条形码测序技术在临床中的应用，为肿瘤的分子诊断提供新的思路和视野。