枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白抗真菌活性及其功能结构域的鉴定

Bacillus subtilis is a kind of extensively applied bio-control bacteria, which can produce many kinds of antifungal substances. Antifungal protein is one of the substances playing an important role in the antifungal activity of B. subtilis and being researched a lot presently. But for most of the antifungal protein which have been isolated, the antifungal mechanism and functional domains are not very clear. Our former study showed that the flagellin of B. subtilis strain F3 had antifungal activity against many kinds of pathogens of plant diseases. In order to define the antifungal activity and antifungal mechanism of B. subtilis flagellin gene, this project will conduct two aspects of studies. One study includes cloning of the flagellin gene of B. subtilis strain F3，constructing of the gene expression vectors, B. subtilis flagellin gene expressing in E.coli, and detection of antifungal activity and concentration of the expressed protein. The other study includes comparation and analysis of the flagellin gene sequences of B.subtilis strains with and without antifungal activity, construction of gene knock-out vectors with deletion or mutant in some amino acid acidues or sequences of flagellin gene, expressing and detection of antifungal activity and concentration of the expressed mutant proteins. This project will finally define the functional domains necessary or/and important to the antifungal activity of B. subtilis flagellin. The achievement of this project will lay a foundation for plant disease bio-control application with flagellin of B. subtilis.

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种应用十分广泛的生防菌，能产生多种抗菌物质，其中抗菌蛋白是目前国内外研究较多的抗菌物质，但是目前对于大多数已分离的抗菌蛋白的抑菌机理及其功能结构域还缺少深入的研究。本项目组在前期研究中发现从枯草芽孢杆菌F3菌株分离的鞭毛蛋白具有抗真菌活性。为了确定枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白的抗真菌活性及其作用机理，本项目拟进行两方面的研究，一方面克隆F3菌株的鞭毛蛋白基因，构建表达载体并在大肠杆菌中表达，测定表达蛋白的抑菌活性与抑菌浓度；另一方面通过比较具有和不具有抗真菌活性的枯草芽孢杆菌菌株的鞭毛蛋白基因的序列，选取其中的部分氨基酸和序列进行缺失与突变，构建相关的敲除载体并进行突变体蛋白表达，测定突变体蛋白的抑菌活性与抑菌浓度。本研究将明确鞭毛蛋白中抗真菌活性必需或/和重要的结构域，为在植物病害生物防治中利用枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白奠定基础。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种应用十分广泛的生防菌，为了提高田间应用效果，目前的研究热点主要集中在枯草芽孢杆菌的生防机理及定殖研究等方面。鞭毛蛋白作为细菌的一种重要的表面蛋白，其结构及生物学功能研究比较多，但是对于土壤细菌，尤其是土壤生防细菌，鞭毛蛋白的生物学功能方面还不是十分清楚。本项目组在前期研究中发现从枯草芽孢杆菌 F3 菌株分离的鞭毛蛋白与菌株的抗真菌活性有关，为了确定枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白与菌株抗真菌活性的关系及其作用机理，本项目对鞭毛蛋白基因的序列特征进行了分析，并对鞭毛蛋白基因进行了表达和转化。通过对28株枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的鞭毛蛋白基因序列分析发现，解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌菌株之间的鞭毛蛋白基因核苷酸序列相似性为90.51%，两个种之间的序列在300bp~700bp之间存在显著差异，枯草芽孢杆菌菌株在该区间有较多片段的缺失。枯草芽孢杆菌菌株之间的鞭毛蛋白基因核苷酸序列相似性为87.57%，可分为两种类型，类型I和类型II。类型II与类型I相比，在106位，148~155位，180~192位，204~210位4个区域的氨基酸序列存在缺失，在100~230之间还有部分氨基酸残基存在差异。具有类型II鞭毛蛋白基因的菌株与具有类型I鞭毛蛋白基因的菌株相比，鞭毛数量少且容易断裂，细菌的浮泳运动和群集运动能力和形成生物膜的能力弱，且细菌及其胞外蛋白粗提物和脂肽粗提物都没有抑真菌活性。通过原核表达和枯草芽孢杆菌菌株间转化这两个试验，我们发现枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白基因的类型与细菌的群集运动和浮泳运动的能力密切相关。由于芽孢杆菌转化与重组效率极低，目前还没有获得鞭毛蛋白基因的敲除转化体，因此还没有证据证明鞭毛蛋白是细菌生物膜形成和抑真菌活性的必要因素。本项目研究中对枯草芽孢杆菌转化的体系进行了优化，极大的提高了枯草芽孢杆菌转化的效率，将对枯草芽孢杆菌分子遗传学研究提供很大的帮助。