枯草芽孢杆菌杀线虫活性物质的鉴定及其机理研究

The previous studies showed that the nematicidal activity from cultures of Bacillus subtilis OKB105 was associated with the pur gene clusters, and the purL gene-deletion mutation M1 lost nematicidal activity. However, the specific mechanism of action remains unclear and the active ingredients have not been identified. The gene-directed mutagenesis and complementary technologies, separation and purification, chemical synthesis and mass spectrometric identification, will be used to elucidate the nematicidal mechanism and reveal the components and structures of active substances and synthesis pathway. The studies will provide a theoretical basis for the research and development of a new biological nematocide.

本课题组前期的研究结果表明，枯草芽孢杆菌OKB105菌株具有很强的杀线虫活性，并且这种活性与pur基因簇有关，突变该基因簇中的purL基因后，活性丧失。但是，该基因簇参与杀线虫的作用机理还不清楚，并且也没有找到相应的活性物质。本项目拟采用基因定点突变与互补技术、活性物质分离与纯化技术、化学模拟合成技术以及质谱鉴定技术等，研究枯草芽孢杆菌pur基因簇参与杀线虫活性的作用机制，揭示活性物质的结构以及相应的合成途径。该研究将为研制和开发新型线虫生防药剂提供理论依据。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OKB105菌株是典型的植物根围促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR），也是研究PGPR与植物有益互作的模式菌株。这类细菌能产生多种抗菌素、酶及杀线虫活性物质，具有广谱的杀线虫活性和极强的抗逆能力，因此，研究此类细菌的抗菌物质的合成调控机理是该互作领域的一个重要方向，也是此类细菌应用的理论基础。本项目以枯草芽孢杆菌OKB105菌株pur基因簇作为研究对象，探索该基因簇的生物学功能、杀线虫物质的成分及合成机制，目前已经取得以下研究进展和结果。(1)、成功构建了pur基因簇合成途径涉及到的15个基因的同源双交换载体；2、成功获得了14个pur相关基因缺失突变株，其中10个突变株发酵上清液，丧失其杀线虫活性，并影响各自的培养性状，其余的4个突变株发酵上清液对杀线虫活性无影响； 3、利用pMA5质粒构建对应缺失基因突变株的穿梭质粒和在发酵培养基中加入腺嘌呤和硫胺都能使丧失杀线活性的10个突变株的杀线活性回复；4、色谱分析发现野生型菌株和突变株的发酵代谢产物不同。本研究初步明确了枯草芽孢杆菌OKB105菌株的pur基因与杀线活性相关，通过调节代谢网络中的中间产物来影响其杀线活性。