稻瘟病菌MoTps1的底物结合机制及其特异性抑制剂的筛选

The rice blast disease caused by Magnaporthe oryzae is a serious threat to world food security, and research on the pathogenic mechanism of M. oryzae will provide strong support for the design of high effective pesticides against it. MoTps1, the trehalose-6-phosphate synthase (TPS) in M. oryzae, is essential for the pathogenicity of the fungus. It is not only a key enzyme for trehalose synthesis, but also involves in the regulation of carbon and nitrogen metabolism by sensing G6P and binding to NADPH. In order to analyze the pathogenic mechanism of MoTps1 and the differences in structures and biochemical mechanisms of MoTps1, OsTPS1 and OtsA, we will purify these TPS proteins and measure the interaction parameters between these proteins and ligands, such as catalytic substrates, NADPH and so on. Meanwhile, the three-dimensional structures of MoTps1, OsTPS1 and their complexes with ligands will be determined by structural biological approaches, and the differences on the patterns of ligand binding, dynamics during ligand binding and the surface characteristics will be analyzed based on the solved structures. Then the specific inhibitors for MoTps1 will be screened virtually on the regions investigated above. These differences are not only the main structural basis of functional differences of TPSs in different species, but also provide a solid basis for virtual screening for specific inhibitors against MoTps1 and further for the design of environmentally friendly fungicides with high efficiency.

由稻瘟菌菌引起的稻瘟病严重威胁世界粮食安全，稻瘟病菌致病机制的研究将为设计高效特异防治稻瘟病的农药提供强有力的技术支撑和保障。海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）MoTps1是稻瘟病菌致病所必需的，它不仅是海藻糖合成的关键酶，还通过感知G6P和与NADPH结合调控碳氮代谢等。为分析MoTps1的致病机制及其与水稻OsTPS1和细菌OtsA在结构和生化机制的异同, 本研究拟综合运用生物化学和生物物理学手段制备各个TPS蛋白；分析其与底物等配体的结合强度和比例；解析MoTps1和OsTPS1自身及其配体复合物的三维结构，建立它们结合配体的模式；分析不同TPS结合配体后的变化动态和参与相互作用界面等的差异以及基于差异区域开展特异性抑制剂的筛选。上述结果将是分析不同物种TPS功能差异分子机制重要的结构基础，还为筛选MoTps1特异性的小分子抑制剂以设计和开发环境友好型高效特异性杀菌剂奠定坚实的基础。

稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）造成的稻瘟病是水稻最严重的真菌病害之一。防治稻瘟菌主要以化学防治为主，但抗药性、生态安全等问题正在日益备受关注。因此，基于靶标进行农药研究，进而开发环境友好型绿色农药，是国内外农药的发展方向。海藻糖的主要合成途径是TPS途径，其关键酶是海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS），催化UDP-葡萄糖（UDP-glucose, UDPG）及葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate, G6P）合成海藻糖-6-磷酸（trehalose-6-phosphate，T6P）。由于TPS在哺乳动物中不存在，所以被认为是设计农药、防治病害的潜在靶标。我们解析了稻瘟菌Tps1（MoTps1）母体、MoTps1/UDPG二元复合物、MoTps1/UDP/T6P三元复合物的晶体结构，以及大肠杆菌TPS（称为OtsA）母体蛋白的结构。基于结构分析了MoTps1与底物互作的分子机制，然后利用表面等离子共振技术和酶活实验，对MoTps1母体及突变体与底物的互作情况进行了检测。通过比较不同物种TPS的序列和结构特征，分析了这些TPS催化过程的异同，并建立了TPS催化过程的工作模型。利用虚拟筛选和高通量筛选方法，获得了一系列MoTps1的小分子抑制剂。通过体外和体内的验证实验，获得了一个的苗头化合物，与MoTps1的亲和力约为26.5 μM，具有生物活性,正在进行共结晶实验和小分子的化学结构优化。本研究阐明了稻瘟病菌MoTps1与底物的结合机制，并获得了一系列特异性抑制剂和一个苗头化合物，为筛选MoTps1特异性的小分子抑制剂以及设计和开发环境友好、高效特异性杀菌剂奠定了坚实的基础。