海洋适冷金属酶MP特异性结合肽的筛选及底物识别机制研究

Psychrophilic enzymes are the metabolic products of the marine microorganism. Understand it through research protein structures, catalytic mechanism and different substrate recognition sites of cold adapted metalloproteases, we can get a little bit deeper into Degradation and circulating mechanism of organism in sea. MP is a novel psychrophilic metalloprotease by marine bacterial YS-80 and is a serralysin-like protein belongs to Metzincin clan. MP has a good future in commercial production. In previous research we expressed its gene and crystallizing .Crystallographic data for these crystals have been obtained and were analyzed. Insoluble collagen may be hydrolyzed by MP. Catalytic mechanism and substrate recognition sites of MP are especial maybe. To solve the problem of stability and extraction, substrate specificity must be clearly described. The result can provide a basis of design for inhibitors and affinity ligands. We plan to screen specificity polypeptide of MP firstly. Then Calculations of absolute binding free energy , the mechanism and dynamics of the molecular recognition were study.

来自深海的微生物可以分泌产生适冷酶，通过研究适冷金属蛋白酶的结构，解释催化机制和底物识别的差异，可以深刻了解海洋有机物的降解和循环机制，也有助于发现蛋白酶的新功能。MP是一种来自于海洋细菌YS-80的新型适冷金属蛋白酶，属于Metzincin类的serralysin酶，有良好工业应用前景，先前已经实现了该酶的表达获得了晶体并进行了结构解析。MP对难溶的胶原蛋白有更好的水解能力，推测其识别和催化机制应有独特之处。为了解决该酶应用过程中的稳定性和提纯困难的问题，必须对底物特异性有更深入的了解，为抑制剂和亲和配基技术提供理论依据。本研究拟通过构建噬菌体展示七肽库的方法，筛选出MP的特异性多肽，借助分子模拟和生物信息学的方法对系列多肽底物进行对接计算，确定MP对结合肽的识别和结合机制关键位点，为设计新型抑制剂或亲和配基提供前期理论基础。

MP是一种来自于海洋细菌YS-80的新型适冷金属蛋白酶，属于Metzincin类的serralysin酶，有良好工业应用前景，MP对难溶的胶原蛋白有更好的水解能力，推测其识别和催化机制应有独特之处。为了解决该酶应用过程中的稳定性和提纯困难的问题，必须对底物特异性有更深入的了解，为抑制剂和亲和配基技术提供理论依据。本研究以mp为作用靶标，利用商品化噬菌体随机七肽库对其进行细胞消减筛选，通过多轮筛选富集获得与靶标特异性结合的多肽，确定一致序列，并对其进行同源序列比对、分子模拟、金属离子亲和层析、体外细胞测定等分析。以MP为靶蛋白，使用噬菌体展示技术筛选出噬菌体单克隆，测序得到两条亲和力较高的结合肽：C8（GLGGAGS）和B3（KLRASKQ）。 C8肽与MP具有较强的结合特性，具有良好的抑制活性。我们对这五个结合复合体结合分子对接和分子动力学的方法,结果显示一个由HIS186， HIS190， HIS196和TYR226组成的一个疏水性的口袋,这个疏水性口袋对于配体-受体复合物的稳定性有显著性作用,并且关键氨基酸TYR226,和配体之间分别形成氢键和共轭键对于复合体的稳定具有重要作用。最后,我们采用MM/PBSA的分析方法分析显示:配体与受体之间形成的van der Waals力是稳定抑制剂与受体里复合物的主要作用力。