II型MEP合酶的催化机制及其底物结合模式的研究

The rise and fast spread of antibiotic resistance of bacteria have forced the researchers in the related areas to seek new biological targets in pathogenic bacteria. One of the most promising targets is the key enzyme 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR), which is essential for isoprenoid biosynthesis in most bacteria. DXR can be inhibited by Fosmidomycin, which had excellent activities against multidrug-resistant bacteria and Plasmodium falciparum, was obtained from the screening using DXR as a target. The latest research has shown that a few pathogenic bacteria such as the emerging human and animal pathogens Brucella do not have DXR, they use an unrelated enzyme DRL (DXR-like, also called type II DXR) as a replacement. The fact that DRL and DXR differ structurally although they catalyze the same biochemical reaction infers that drugs could be specifically designed against DRL. In this research propose, we plan to clarify the catalytic details of DRL by using B. abortus DRL as a target and isotope labeling and exchange techniques as tools. The results will provide reasonable basis for screening new antibiotics utilizing the newly discovered DRL.

细菌耐药性的出现与蔓延迫使研究者们不断寻找新的药物靶点。萜类生物合成过程中的关键酶2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）合酶，又称1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶（DXR）是目前最有前景的抗菌素筛选靶标之一。以DXR为靶点筛选的抗菌素膦胺霉素对多重耐药菌和恶性疟原虫都有很强的抑制作用。最新的研究发现布鲁杆菌属（Brucella）等致病菌的菌体内不存在DXR，而是被DRL（DXR-like，又称Ⅱ型DXR）所替代。虽然DRL与DXR的功能相同，但是两者的结构差异很大，因此以DRL为靶点进行筛选则可能发现对布鲁杆菌属等病原微生物更专一的抗菌化合物。本研究拟以流产布鲁杆菌（B. abortus）DRL为靶酶，利用同位素标记技术及同位素交换技术详细分析该酶催化合成MEP的反应过程，以期阐明DRL的催化机制及其与底物的结合模式，为以该酶为靶点筛选抗菌化合物提供坚实的理论依据。

萜类化合物MEP生物合成途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶（DXR）是最有前景的抗菌素筛选靶标之一。以DXR为靶点筛选的抗菌素膦胺霉素已经用以治疗由多重耐药菌和恶性疟原虫引起的感染。最新的研究发现一些主要致病菌如巴尔通体属和布鲁杆菌属的菌体内不存在DXR，而是被一种DRL酶（DXR-like, 或称Ⅱ型DXR）所替代。虽然DRL与DXR的功能相同，但是两者的结构差异很大，因此可针对DRL筛选其专一的抗菌化合物。这首先需要研究清楚DRL的催化作用机制。关于DXR的催化作用机制曾有两种假设，一种是分子内重排的α-ketol机制，另一种假设是分子间重排的retro-aldol/aldol机制，最终retro-aldol/aldol机制被认可，但此机制的一些细节问题仍需阐明。本研究在我们已完成工作的基础上，利用亲和层析技术制备了高纯度、高活性的DRL蛋白，进而利用同位素交换技术（18-O）、质谱技术（MS）、核磁共振技术（H-NMR及C-NMR）等探讨了它在催化合成MEP过程中的作用机制，认为：.1）DRL在催化DXP向MEP转化时，也是通过retro-aldol/aldol作用机制；.2）底物DXP与酶DRL-金属离子的结合方式是通过其C3及C4的两个羟基完成的，即酶与底物的C3-C4结合模式。.同时，结合前期的研究结果，我们提出了DRL的催化循环模型，为以该酶为靶点筛选抗菌化合物提供了坚实的理论依据。