辣椒雄性育性恢复位点qRf2.1的精细定位与候选基因分析

Pepper has obvious heterosis, it can not only save time and labour, but also ensure the purity of seeds using cytoplasmic male sterile line to produce hybrid seeds of pepper. In this study, The major restorer-of-fertility loci qRf2.1 of pepper will be fine mapped, and then the restorer-of-fertility gene will be predicted through resequencing, nucleotide sequence blast, candidate gene expression analysis, protein functional analysis and validation. The analysis of bioinformatics and experimental biology will be combined to accomplish the desired goals. The aim of this project is to clarify the molecular mechanism of restorer-of-fertility, explore the major restorer gene. The expected result will have profound theoretical significance, important pratical value and wide application prospect for speeding up the molecular innovation of restorer germplasm in long pepper.

辣椒杂种优势明显，利用CMS生产杂交种子不但省时省工，而且还能确保种子纯度。对恢复基因的研究可以加速CMS育种进程。本项目拟对辣椒主效恢复位点qRf2.1进行精细定位，并基于重测序技术、生物信息学与实验生物学分析相结合的方法，通过DNA序列比对、候选基因的表达模式分析、蛋白质结构域预测与功能分析等相关研究，预测主效恢复基因，旨在阐明辣椒育性恢复的分子机理，发掘辣椒主效恢复基因。预期结果对于加快辣椒恢复系种质的分子创新具有深远的理论意义，重要的实践价值和广阔的应用前景。

辣椒杂种优势明显，但常规杂交制种时需要对母本进行人工去雄，费时费工，且杂种纯度难以保证。而利用辣椒CMS三系配套法生产杂交种子，不需要人工去雄，能够减少80%左右的人工杂交成本。目前已经克隆出辣椒CMS基因，但对其育性恢复的分子机理尚不明确，也尚未克隆出恢复基因，从而限制了辣椒CMS三系配套品种的选育和在杂交种子生产上的应用。本项目通过集团分离分析法（BSA）结合高通量测序技术，筛选出Capana00g002348、Capana00g004424、Capana02g000930、Capana00g003267、Capana01g002849、Capana05g002270、Capana01g004065、Capana06g002131和Capana02g001595等9个与辣椒胞质雄性不育育性恢复紧密相关的基因，它们分别依次编码果糖激酶、磷脂酰肌醇磷酸激酶、果胶裂解酶、外多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、纤维素合成酶、束状阿拉伯半乳聚糖蛋白、磷脂酶C（PLC）和ABC转运蛋白，均是花药和花粉发育过程中的关键酶与蛋白。并将辣椒CMS育性恢复基因定位到染色体6上一段跨度18.6M的区间上，该区间包含212个基因。通过基因差异表达分析，筛选到5个基因（Capana06g002839、Capana06g002848、Capana06g002866、Capana06g002871和Capana06g002913）在恢复系和恢复池中均上调表达，而在不育系和不育池中均下调表达。基因扩增结果表明只有Capana06g002866仅在恢复系中扩增出555bp的目的片段，而未在不育系中扩增出目的片段。Capana06g002866在不育系花蕾各个时期中的表达量极低，而在恢复组合中和恢复系中的表达显著高于不育系，且随着恢复组合花蕾的发育，其表达量迅速上升。因此，Capana06g002866被认为是辣椒CMS育性恢复关键候选基因。Capana06g002866全长555bp，编码184个氨基酸，生物信息学分析表明Capana06g002866编码类泛素结合酶（NEDD8-conjugating enzyme）。因此，本项目为进一步解析辣椒CMS育性恢复的分子机理奠定了基础，同时为开发辣椒CMS育性恢复的分子标记提供了分子基础，进而能够加速辣椒CMS三系育种进程，推动CMS三系制种在辣椒杂交制种