辣椒育性恢复基因诱导表达的重要候选基因克隆与功能分析

雄性不育在杂种优势利用中具有重要的经济价值和理论研究意义，倍受国内外研究者的重视。但相关研究大多集中在不育基因及其转录产物和生理生化的分析上。本项目从辣椒恢复基因诱导表达的相关基因入手，以辣椒CMS不育系和近等基因系恢复系为试验材料，利用抑制消减杂交技术（SSH）构建恢复基因诱导表达的消减cDNA文库，通过基因功能注释及分类分析筛选获得与控制植物花瓣和雄蕊发育有关的AP3/DEF和PI/GLO等2个B类候选基因。并通过RACE技术获得2个基因的全长。进一步分别构建及转化GFP重组表达载体研究2个基因在辣椒或番茄上的表达部位和表达量，同时用RNAi技术分别抑制2个基因的表达量；对获得的转基因植株观察花器形成和育性表现（包括生理生化），从而分析2个基因与辣椒育性的关系，探讨辣椒育性表达的分子机理。为从基因水平调控辣椒育性提供理论依据，同时为其他植物育性研究和性别调控提供借鉴。

以辣椒不育系、保持系、恢复系（近等基因系）为试验材料，利用SSH、cDNA-AFLP技术构建了4个育性相关基因表达差异EST和TDFs库。根据功能注释、表达差异和在各库中的表达情况，筛选得到7个可能与育性相关的候选基因。利用RACE技术对7个基因进行全长cDNA 克隆，并利用半定量RT-PCR 和荧光定量PCR技术检测了7个基因在辣椒不同器官上的表达特性。这7个基因均只在可育株上表达或可育株的表达量明显高于不育株，并且在花器官上特异表达，花药中表达量更高。其中PAP3（AP3/DEF）、PPI（PI/GLO）基因属花器官发育MADS-box基因家族B类功能基因，直接控制花瓣和雄蕊的形成，CaSEP1 是B类和C类基因行使功能所必须的基因；CaPROF基因是前纤维蛋白基因，主要参与调控肌动蛋白聚合形成微丝，可能参与花粉细胞骨架调节而影响雄蕊育性；CaOle e 6基因功能目前还不清楚，但仅在花药中表达；CaPCP基因是花粉外壁蛋白基因，可能通过影响花粉外壁蛋白的形成而影响雄蕊育性；CaNAC基因是花药特异表达基因，可能与花药发育相关。. 对PAP3和PPI基因功能采用VIGS技术进行验证，结果表明沉默PAP3或PPI基因，花药中基因表达量明显的降低，造成辣椒花药退化，无花粉粒，导致雄性不育，说明PAP3和PPI基因均有调控辣椒花药形成的功能；通过酵母双杂交，体外GST-Pull down验证了PAP3和PPI两个蛋白之间存在互作关系；半定量RT-PCR及荧光定量qPCR、RNA原位杂交结果均表明，PAP3基因在花药发育的后期表达量增高，在恢复系中的表达量高于不育系，推测PAP3基因在花药发育的后期起到重要的作用，并且在不育系中的表达可能受到了抑制。同时，RNA原位杂交显示，PAP3基因具有B类基因的表达特性，即在雄蕊、花瓣内高丰度表达，以雄蕊表达最高；在雌蕊中也有不同程度的表达，而在萼片中没有表达。洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示，PAP3蛋白定位于细胞核，符合MADS-BOX基因家族转录因子的表达特性。. 通过本项目研究初步证明了与花器官形成有的PAP3和PPI基因可以调控辣椒花药的形成，抑制其表达可造成花药退化，造成辣椒雄性不育，并探讨了PAP3基因表达的分子机理，为从基因水平调控辣椒育性提供了理论依据，同时为其他植物育性研究和性别调控提供借鉴。