生防脱叶链霉菌FT05W几丁质酶关键调控因子的挖掘与功能解析

Streptomyces exfoliatus FT05W, producing chitinase, is a high-efficient biocontrol strain against lettuce drop disease caused by Sclerotinia Sclerotiorum. Chitinase could degrade chitin, the major component of fungal cell wall, and prevent the development of fungal pathogen. However, S. exfoliatus FT05W chitinase family genes, as well as their regulator, are largely unknown. Therefore, we will first focus on mining of chitinase family and candidate regulation genes in S. exfoliatus FT05W based on its whole-genome sequencing; disturbing each candidate regulation gene to obtain its mutant strain; evaluating the levels of chitinase family genes expressions in each mutant. Secondly, we will compare the induction system of chitinase, as well as the production, in each mutant strain to the wild-type strain, and to finally obtain the chitinase-defficient mutant strain: Chi-Null FT05W. Afterwards, we will take advantage of the FISH (Fluorescence in situ hybridization) techniques to compare the colonization patterns of lettuce by FT05W and Chi-Null FT05W. Finally, we will determine their antagonisms against S. Sclerotiorum in vitro and in greenhouse. Our study will enrich the understanding of chitinase in the biocontrol mechanisms of Streptomyces spp, as well as the role of the chitinase regulator in S. exfoliatus FT05W for plant pathogen suppression. As a whole, the expected results will contribute to the evidence and basis of developing S. exfoliatus FT05W as a novel environmental-friendly bio-pesticide in future.

脱叶链霉菌FT05W是高效防治生菜菌核病的生防菌株。该菌株产生几丁质酶，几丁质酶可降解真菌的细胞壁主要成分几丁质，导致真菌细胞破裂或死亡，从而阻止病害的发生和发展。因此，本研究以FT05W为研究对象，在全基因组测序基础上鉴定几丁质酶家族基因和筛选调控因子，对候选调控因子分别构建阻断质粒以获得其突变菌株，对各突变菌株中几丁质酶家族基因的表达水平进行研究，确定该调控因子的调控效率，同时研究突变菌株与野生型菌株的几丁质酶诱导途径及产生情况，进一步获得几丁质酶缺乏突变菌株Chi-Null FT05W，随后采用原位荧光杂交技术对比其与野生型菌株在生菜上的定殖能力及特性，最后比较两菌株对核盘菌的拮抗作用及菌核病的温室生防效率。研究结果将丰富我们对几丁质酶在链霉菌生物防治作用机理中的认识，明确几丁质酶调控因子对FT05W抑制核盘菌的调控作用，为FT05W作为新型环境友好杀菌剂的创制提供理论依据。

生防脱叶链霉菌FT05W是一株从小麦根系分离的植物内生链霉菌，对核盘菌（Sclerotinia spp）、镰刀菌（Sclerotinia spp）、黑孢菌（Nigrospora spp）等植物病原菌具有良好的抑菌活性与生防潜力。链霉菌FT05W产生几丁质酶，几丁质酶可降解真菌的细胞壁主要成分几丁质，导致真菌细胞破裂或死亡，从而阻止病害的发生和发展。本研究以FT05W为研究对象，利用 Miseq PE300测序平台对链霉菌FT05W全基因组测序并开展几丁质酶相关基因鉴定工作。结果表明，链霉菌FT05W基 因 组 测 序 数 据 量 为2081170588 bp，共获得6914188个reads，平均序列长度为301 bp。通过SPAdes软件对序列进行拼接共得1836个contigs，其基因组全长为7699129 bp，预测出7434个蛋白编码基因（GenBank 登录号：NZ_QGMR00000000）。同时，本研究还对FT05W基因组进行了基因组注释、基因功能分类、比较基因组学、构建数据库等相关研究，共在链霉菌FT05W中鉴定出8个几丁质酶家族基因，其中7个为18家族几丁质酶基因，1个19家族基因，其中ChiD、ChiO、ChiP为新发现的链霉菌几丁质酶家族基因；对链霉菌FT05W中几丁质酶家族基因ChiA、ChiB、ChiC、ChiD、ChiN、ChiO、ChiP进行实时荧光定量分析，同一生长时期，18家族基因的相对表达水平均高于19家族基因，其中 ChiD基因的相对表达量最高。此外，确定了链霉菌FT05W中存在候选几丁质酶调控因子misK。构建misK基因阻断质粒以获得其突变菌株misK-Null FT05W，与野生型菌株相比，misK-Null FT05W突变菌株中几丁质酶家族基因的表达水平显著下降，明确了misK基因是生防链霉菌FT05W几丁质酶的重要调控因子。随后采用安普抗性标记，对比了misK-Null FT05W与野生型菌株在生菜上的定殖能力，发现二者无显著差异。最后比较了两菌株对生菜菌核病的温室生防效率，发现突变菌株生防能力明显下降。研究结果丰富了我们对生防链霉菌几丁质酶家族基因多样性及重要调控因子功能作用的认识，为未来生防链霉菌几丁质酶相关研究提供了参考。