生防芽孢杆菌几丁质酶表达调节的分子基础

从苏云金芽孢杆菌几丁质酶合成调节方式的多样性入手，以不同表达类型的几丁质酶基因（chi）为研究对象，通过有针对性地诱变和缺失调节区域碱基而改变原基因表达方式的手段，确定几丁质酶基因调节区的遗传元件，寻找影响几丁质酶基因启动子效率的关键碱基，有可能从基因调节区域的特点揭示细菌组成型及诱导型合成几丁质酶的转录调节规律,为Bt几丁质酶尽早用于生物防治奠定基础。研究内容包括：克隆一系列典型组成型和诱导型chi全长基因，包括ORF及上游完整的调节区域，在E.coli中异源表达。预测出潜在的启动子序列，确定不同表达类型基因调节区域内在的规律性和碱基差异，有针对性地进行定点诱变和启动子的系列碱基缺失。诱变后在酶合成及mRNA转录水平上观察基因在表达方式上的变化。最终确定几丁质酶组成型、诱导型表达的各自基因启动子序列和其它遗传元件，确定芽孢杆菌chi基因表达方式的最小调节区域及其关键调节位点。

本研究旨在确定Bt几丁质酶表达方式的基础上，研究该基因的遗传调控元件，从而为揭示几丁质酶基因表达调节机理提供理论依据。.为了对生防芽孢杆菌几丁质酶的表达方式有系统、全面的了解，采用DNS法检测了104株菌在有或无诱导物培养基中的几丁质酶活力，经过对数据的归纳分析后，首次发现了芽胞杆菌几丁质酶基因表达调控的多态现象。.为研究chi基因表达调节的分子基础，需要构建一个带有无启动子报告基因的载体。将基因bgaB作为报告基因，在穿梭载体pHT315的骨架上构建了载体pCB。并证明该载体完全可以开展本研究计划的后续所有工作。.通过对chiA调控序列的一系列缺失突变子对酶活力影响的分析，发现调控区域中长75 bp的序列是chiA基因的核心启动子。研究发现和证实在核心启动子下游、-20 bp处上游附近存在一个应答几丁质诱导的负调控位点，缺失或破坏这个位点导致chiA启动子引起酶的组成型表达。另外，通过5′RACE技术，证实chiA启动子内 -46 bp处的“A”碱基是基因的转录起始位点，由此确定chiA启动子的-35区和-10区分别为“TTACAA”和“TATCAT”，间隔17 bp。.通过对chiB调控序列的一系列缺失突变子对酶活力影响的分析，证实chiB调控序列中112bp，既从上游-232至-121 bp位点之间的序列为基因的核心启动子。同时证实chiB基因转录起始位点为-132 bp处的“C”碱基。chiB基因启动子的-35区和-10区序列分别为“TTTACA”和“TACGAT”，间隔17 bp。.缺失分析发现，chiB基因内存在一个16 bp应答几丁质诱导的负调控位点—dre(AGACTTCGTGATGTCT)。该位点是一个保守序列，具有部分反向重复序列的特点。缺失或部分缺失这个序列导致chiB启动子为组成型表达，因此证实dre位点参与了chiB基因诱导表达的调节，通过体外凝胶电泳迁移率变动分析证实，Bt存在一种蛋白，在无诱导物的情况下能够结合包括dre位点在内的调控区域。同时发现和证明，其中一些碱基对于dre位点行使功能起着至关重要的作用。上述有关chiA、chiB基因表达调节关键遗传元件的研究结果，为深入研究调控蛋白，为最终提出Bt几丁质酶表达调控模型提供了研究基础。