生防链霉菌Men-myco-93-63中nsdB等调控基因的克隆及功能验证

玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）Men-myco-93-63是一株很有生防应用潜力的链霉菌，该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌、瓜类白粉病菌、番茄灰霉病菌等多种农业生产上重要的植物病原菌都表现出很强的拮抗作用，并且田间防效良好。我们已建立起该菌株的遗传转化体系，并从中克隆和验证了一个负调控基因- - nsdA基因的全长和功能。在此基础上，本项目将根据模式链霉菌中的nsdB、rrdA、tcrA、afsR等负、正调控基因的保守序列设计引物，扩增Men-myco-93-63基因组，克隆该菌株中的调控序列，并通过基因阻断和转化试验来验证这些调控基因在该生防菌中的功能，为探明玫瑰黄链霉菌代谢途径及实现该生防菌的遗传改良奠定重要的基础。

玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）Men-myco-93-63 是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离得到对棉花黄萎病菌表现强烈抑制作用的菌株。在室内及大田实验中，该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌、黄瓜白粉病菌、番茄灰霉病菌等十几种植物病原菌表现出较强的抑制作用，在植物病害生物防治方面表现出良好的开发应用潜力。根据检索到的天蓝色链霉菌中发现的全局性调控基因 nsdB 基因的序列设计引物，对 Men-myco-93-63 进行 PCR 扩增，获得 1121 bp 的片段，以该片段为靶序列，设计引物利用非特异引物锚定 PCR（NPA-PCR）方法对其两端进行延伸，拼接后得到 2073 bp 的全长序列。全长序列包含一个完整的开放阅读框，编码 464 个氨基酸，与天蓝色链霉菌 A3(2) 中 nsdB 基因核苷酸序列有 87 % 同源性，将此全长基因命名为 nsdBmgh。经 Southern 杂交验证，该基因在 Men-myco-93-63 基因组中确实存在，且为单拷贝。用基因破坏型质粒 pKC1139 构建单交换载体 pSRNA1121（pKC1139::1121bp nsdBmgh）来阻断该负调控基因，通过转化 ET12567（pUZ8002）获得接合转移供体菌 ET12567（pUZ8002，pSRNA1121），利用接合转移将其导入玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中，得到了基因中断突变株。根据天蓝色链霉菌 A3(2) 中 rrdA 基因（regulator of redD）序列设计引物，对Men-myco-93-63 进行扩增获得 393 bp 的片段，再经全长序列扩增引物 rrdA–1 和 rrdA–2 克隆到该基因的全长序列 809 bp，包含一个完整的开放阅读框，共编码 221 个氨基酸，与目的基因核苷酸序列同源性为80 %，命名为 rrdAmgh。根据天蓝色链霉菌 A3(2) 中的其他三个正、负调控基因tcrA、sarA 和 scrX 序列设计引物，对Men-myco-93-63 进行扩增，分别获得 705 bp、1472 bp 和 473 bp 的片段，与目的基因核苷酸序列同源性均为 99 %，推测 Men-myco-93-63 中也可能含有这三个调控基因。发表相关学术论文 14 篇，获得国家发明专利 2项。