热稳定核酸酶调控eDNA介导金葡适应PJI环境的分子机制研究

Staphylococcus aureus associated prosthetic joint infection (PJI) is a devastating complication of arthroplasties, and bacterial biofilm is the key to the pathogenesis of PJI. Extracelluar DNA (eDNA) is an essential component of staphylococcus aureus biofilm in vivo, as well as neutrophil extracellular trap (NET). Regulation of eDNA is one of the elementary factors in the early phase of staphylococcus aureus biofilm formation. The secretory thermonuclease 1(nuc1)of staphylococcus aureus facilitates bacterial escape from NETs by degrading eDNA while simultaneously, hampers biofilm formation in the early phase, playing a paradoxical role in the pathogenesis of PJI. The membrane attached thermonuclease2 (nuc2) of staphylococcus aureus is functional in regulating eDNA while its exact pathogenic role in vivo remains uncovered. In the preliminary studies, our group discovered a “reverse regulation” relationship between nuc1 and nuc2, and a function differentiation phenomenon in bacterial community in the situation of PJI. Therefore, we propose a hypothesis that staphylococcus aureus achieves adaption to PJI environment through two mechanisms. On the basis of preliminary studies, this project plans to construct a thermonuclease fluorescence reporter staphylococcus aureus and a Tet（on/off）plasmid, and use a staphylococcus aureus, neutrophil and implant material co-culture system as well as an in vivo real time quantitative bioluminescence PJI animal model, to verify the scientificity of our hypothesis. In addition, bivalent cations will be loaded into oxidative surface nanotube to intervene the adaptive surviving strategy of staphylococcus aureus in PJI environment, which intends to provide new insight and method for the prophylaxis and treatment of clinical staphylococcus aureus induced PJI.

金葡假体关节感染（PJI）是关节置换严重并发症，细菌生物膜是致病中心环节。细胞外DNA（eDNA）是体内金葡生物膜的组成要素也是中性白细胞胞外诱捕网（NETs）的重要成分，eDNA的调节是金葡PJI早期生物膜形成关键因素之一。金葡分泌型热核酸酶1降解eDNA促进细菌逃避NETs，却抑制生物膜形成，表现出致病作用矛盾性。金葡膜表面型热核酸酶2具有eDNA调节功能，但其体内致病作用不明。课题组前期研究发现，PJI环境中金葡2种热核酸酶存在反向调节和菌群分工现象，并提出金葡通过2种机制适应PJI环境的假说。本项目在前期工作基础上，构建热核酸酶荧光报告菌株和Tet（on/off）开关质粒，利用金葡-白细胞-假体材料共培养体系及新型生物发光PJI动物模型验证假说的科学性。并拟通过钛基表面氧化纳米管涂层装载二价阳离子释放，干预金葡对PJI环境这种适应性生存机制，为临床防控提供一种崭新的思路和方法。

金葡菌PJI感染一直是骨科感染的难点和重点之一，热稳定核酸酶是金葡菌的重要毒力因子之一，一方面调控生物膜的重要构成成分eDNA，另一方面降解中性粒细胞诱捕网（NETs）逃逸免疫。由于前人的研究尚不能解释核酸酶如何平衡eDNA和NETs降解之间的矛盾功能关系，并且nuc1和nuc2两种核酸酶各自发挥的功能与相互关系未能得到解释。.本项目首先针对临床PJI来源的金葡ST1792，构建不同核酸酶敲除菌株和不同荧光金葡；通过体内荧光空间构象分布等系列研究发现nuc1与nuc2在生物膜形成、细菌间黏附中的重要作用；利用不同的PJI动物模型验证了nuc1是血源性感染的重要毒力因子，而nuc2与nuc1在局部感染的PJI中有同样重要作用；通过生物信息学分析手段，首次发现nuc1与nuc2表达模式在生长周期中存在相互补充的关系；并通过体外表达研究，提示某些抗生素压力对nuc1与nuc2表达影响可能促进生物膜形成，进一步分析骨科感染临床金葡菌发现nuc1、nuc2的转录水平较非骨科感染金葡菌更低。.在探索金葡菌PJI感染的机制问题同时，课题组通过构建免疫细胞荧光标记的Lys2-eGFP小鼠，使用红色荧光金葡菌感染造模的方法建立新的PJI动物模型，并借助双光子共聚焦显微镜实现体内原位显微观察免疫细胞和细菌实时动态变化；基于各种已有的研究平台，开发了一系列新型抗菌材料如光热抗菌材料、金属纳米抗菌涂层、自组装肽抗菌水凝胶，并探索了这些生物材料的抗金葡内植物感染机制；结合虚拟筛选技术，发现了新型抗金葡生物膜小分子化合物，并研究了非甾体类抗炎药非诺洛芬，小檗碱及氨甲环酸等药物在金葡菌内植物感染中的作用。.本研究探明金葡菌PJI感染中热稳定核酸酶的致病机制，同时基于金葡内植物感染的多种机制，采用不同材料制备手段及药物筛选技术，提出新的具有转化前景的抗金葡内植物感染方法，为今后PJI治疗手段的开发提供重要理论基础。