二元调控子GraRS在达托霉素耐药金葡菌形成中的表达调控分子机制研究

Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) remains one of the principal multiple resistant bacterial pathogens causing serious healthcare-associated and community-onset infections. Daptomycin is one of the last defense to treat severe infections caused by MRSA. However, the daptomycin-resistance-MRSA bring new challenges. Among those genes correlated with daptomycin susceptibility, two-component regulatory systems of GraRS were suggested to regulate mprF and dltABCD, but the molecular regulation mechanism is still immature. We also found graRS mutation in daptomycin-resistance strains. We suggested that graRS mutation are tightly correlated with the interaction between graRS and multi-affected genes, changing cell membrane charge and daptomycin susceptibility. Firstly, we construct graRS deletion mutants and complemented strains, screen targeted genes with comparative transcriptomics. Secondly, a few molecular methods will be employed in study the regulatory mechanism of GraRS to targeted genes. These studies will elaborate the regulatory net work of GraRS, and the relationship between daptomycin-resistance and graRS mutations, thus provide some evidence for the control of daptomycin-resistance-MRSA.

达托霉素敏感性下降的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）给临床治疗带来新的挑战。文献报道金葡菌对达托霉素耐受性提高与多个基因有关，其中二元调控子GraRS可以调节mprF和dltABCD等基因，但其表达调控分子机制仍有待研究。我们在达托霉素耐药突变株中发现了graRS的突变。为证实“graRS在部分耐药株-敏感株间存在遗传变异，导致调控子GraSR-靶基因间调控关系发生变化，从而改变细胞膜电荷，引起达托霉素耐受性改变”这一假说，我们采用基因敲除与回补、比较转录组分析等筛选受GraRS调控的耐药靶基因；采用lacZ报告基因融合实验、引物延伸实验、凝胶阻滞实验、DNase I足迹实验等研究GraRS如何调控靶基因的转录表达。深入探究GraRS-耐药靶基因的调控环路，阐明graRS遗传变异与达托霉素耐药性发生变化的关系及其分子调节机制，为达托霉素耐药MRSA的防控提供部分依据。

对12座城市22家医院的血流感染金葡菌进行分型研究，发现2013年最多的ST239-t030-MRSA，其主导地位在2016年被ST59-t437取代；耐药性强的ST239-t030-MRSA，其生长速度比后者慢，且在混合培养中处于生长劣势。从血流感染常见流行克隆中选择三株金葡菌，体外连续筛选获得达托霉素耐药突变株（MIC=16 μg/mL），耐药株具有较强的稳定性，160-210代后仍可耐受4 μg/mL达托霉素；耐药株细胞壁增厚，生长速度降低，均具适应性代价（15.0%-34.8%），体内外血清耐受能力降低，小鼠致病或致死能力降低。对三个系列突变过程的15株菌进行全基因组测序，SNP分析显示，3M系列中walK (L7Q、Y225N)和mprF (G299V、L473I)，14M系列中mprF (A96V、L826F)，5M系列中的graS (S52N)、walK (F473I)和mprF (T345A)相继突变，对于达托霉素MIC的持续上升具有重要作用。构建了金葡菌5M0的graS敲除株5M0△graS，其达托霉素MIC由0.5 μg/mL降至0.125 μg/mL，替考拉宁MIC由0.75 μg/mL降至0.25 μg/mL。通过qPCR分析比较graS敲除前后菌株细胞壁合成相关基因的表达水平。相比5M0，敲除株5M0△graS的walR的表达显著下降（P=0.0287），ssaA的表达显著上升（P=0.0017），graR的表达上升（P=0.0731），altA的表达下降（P=0.0952）。对三个系列的15株菌的graR、walR、altA和ssaA四个基因进行qPCR分析，暂未发现达托霉素耐药株的逐步形成与这些基因表达水平之间的对应关系。GraRS的精细调控仍在继续研究中。本研究从适应性的角度解释了血流感染金葡菌的种群构成变化；填补了我国关于达托霉素耐药菌株报道的空缺，研究了GraRS的调控机制，并为防止和应对临床上可能出现的达托霉素耐药株提供了研究基础。