基于光遗传学和CRISPR技术研究组蛋白乙酰化调控Fas表达水平在维持大肠癌干细胞特性中的作用及机制

Many studies have shown that the carcinigenesis and progression of colorectal cancer (CRC) are closely associated with the existance of cancer stem cells. Colorectal cancer stem cells (CCSC) are characterized by self-renewal, multi-lineage differentiation potential, chemotherapy resistance and strong tumorigenicity. Therefore, the molecular mechanisms maintaining the characteristics of CCSC is the basis and prerequisite for eliminating CCSC. Our group firstly found that Fas was upregulated in CCSC, and the up-regulation was caused by the acetylation of histone. Studies in vitro and in vivo further confirmed that the traits of CCSC such as sphere-forming, the expression of stem genes and tumorigenesis were suppressed after Fas was knock-down. These results suggest that Fas may be a novel molecule maintaining the characteristics of CCSC rather than promoting the apoptosis of CCSC. However, the concrete molecular mechanisms of Fas involved in maintaining the characteristics of CCSC and the up-regulation of Fas in CCSC have not been reported yet. Based on our previous acheivements, we will complete the biological functions of Fas in CCSC, identify the key partners of Fas, and clarify the new epigenetic mechanisms of Fas up-regulation in CCSC through the light-inducible loci specific histone deacetylation system using optogenetics and CRISPR technology. This study will afford a new target in CCSC interference therapy and generate a novel strategy for CRC therapy.

研究表明大肠癌（CRC）发生发展与大肠癌干细胞(CCSC)密切相关。CCSC具有自我更新能力、多向分化潜能、治疗抵抗以及强致瘤性等特性，因此阐明维持CCSC特性的分子机制是靶向清除CCSC的基础和前提。我们前期研究首次发现Fas在CCSC中上调，且与组蛋白乙酰化相关。敲除Fas后CCSC克隆球形成能力、干性基因表达以及致瘤能力明显降低，提示Fas可能是促进CCSC特性的重要分子之一,而非促细胞凋亡。但Fas促进CCSC特性的关键分子及如何上调的分子机制迄今未见文献报道。本课题拟在前期研究的基础上，进一步完善Fas在CCSC中的生物学功能；并筛选和鉴定Fas相互作用关键靶分子并解析其生物学功能，以及通过基于光遗传学CRISPR介导的位点特异性组蛋白去乙酰化技术平台来阐明促使CCSC中Fas上调的表观遗传学新机制，由此为靶向清除CCSC提供新靶点，为CRC治疗提供新的策略。

研究背景：肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell, CSC）是一群具有很强自我更新能力和多向分化潜能的细胞，虽只在肿瘤组织中占很小比例，但对放化疗天然抵抗且在放化疗后明显富集，是肿瘤治疗和控制转移复发的难点所在。我们前期研究发现 Fas 在 大肠癌干细胞（CCSC） 中高表达， 但是功能未见报道。.研究内容：利用shRNA慢病毒敲除了CCSC中的Fas，比较干性特征改变：克隆球形成能力、干性基因表达及致瘤能力；分选出Fas高表达和Fas低表达的两群细胞进行RNA 高通量测序，筛选关键基因；通过RT-qPCR验证关键基因的表达，并利用shRNA慢病毒敲除关键基因后，比较克隆形成能力；建立了基于光遗传学技术CRISPR介导的基因位点特异性组蛋白去乙酰化系统，抑制Fas启动子区组蛋白乙酰化后检测Fas 表达水平； CCSC中给予 FasL激活剂处理，检测细胞凋亡；通过oncomine数据库和组织芯片对Fas的预后价值进行了探索。.研究结果：敲除了CCSC中的Fas后，克隆球形成能力、干性基因表达及致瘤能力明显降低；通过对Fas高表达和Fas低表达的两群细胞进行RNA 高通量测序，测序结果筛选到81个差异基因，其中Fas 高表达细胞群中75个基因上调，6个基因下调，而MALAT-1上调最为显著；通过RT-qPCR也证实 Fas高表达的大肠癌细胞中MALAT-1明显升高，进一步敲除Fas高表达的大肠癌细胞中MALAT-1后，克隆形成数量和直径明显降低；建立了基于光遗传学技术CRISPR介导的基因位点特异性组蛋白去乙酰化系统，并构建了该系统所需的gRNA-CIB1-dCas9，pEF1α-CRY2PHR- SID4X（HDAC），利用该系统，抑制Fas启动子区组蛋白乙酰化后可以明显抑制Fas 转录激活；利用CCSC中Fas高表达，给予FasL激活剂选择性诱导CCSC凋亡；通过oncomine数据库和组织芯片对Fas的预后价值进行了初步的探索，发现大肠癌组织中Fas较癌旁组织中的表达水平低，肿瘤中Fas高表达预后更好（p=0.016），这可能与Fas在大肠癌中的双重作用（促凋亡和干性特征）相关。.结论：我们揭示了Fas 在 CCSC 中的新的生物学功能（非促细胞凋亡）并鉴定了其关键靶分子，可为大肠癌的靶向干预 CSC 提供新的思路，具有重要的临床生物学意义。