HBx对肝干细胞增殖分化影响的机制研究

本研究拟探讨 HBV 编码的调节性蛋白 HBx 对肝干细胞体内/外增殖分化的影响，阐明其在原发性肝癌发生中的作用机制，为肿瘤发生的确切机制及抗肿瘤新药靶点的筛选提供理论基础和实验依据。本研究构建一种靶向于肝干细胞的肿瘤动物模型，更能模拟原癌基因损伤后自发突变导致的肿瘤发生过程，直接研究 HBx 对肝干细胞的作用，通过肝干细胞增殖、分化的改变，了解有无肿瘤发生的趋势，或促进肿瘤发生的趋势。从而明确 HBx 是否是通过对肝干细胞增殖分化的影响引起原发性肝癌的发生，为肿瘤动物模型的构建提供了新的思路。为我们进一步深入研究其发生机制奠定基础，同时也为临床治疗提供依据。

本研究拟探讨 HBV 编码的调节性蛋白 HBx 对肝干细胞体内/外增殖分化的影响，阐明其在原发性肝癌发生中的作用机制，为肿瘤发生的确切机制及抗肿瘤新药靶点的筛选提供理论基础和实验依据。从而明确 HBx 是否是通过对肝干细胞增殖分化的影响引起原发性肝癌的发生，为肿瘤动物模型的构建提供了新的思路。为我们进一步深入研究其发生机制奠定基础，同时也为临床治疗提供依据。（一）以腺病毒 Ad-HBx 和 Ad-GFP 感染肝前体细胞Hp14-19，证明HBx 可抑制肝前体细胞的分化，这可能是最终导致肝前体细胞恶性转化的原因之一。（二）Bx可通过促进HP 14-19细胞中GSK3β磷酸化，抑制β-catenin的降解，从而导致β-catenin在胞质中大量积聚并向核内转移。HBx对肝前体细胞中经典Wnt信号通路的激活，可能是导致肝前体细胞恶性转化的分子基础。）（三）HBx 可通过调节Bcl2 家族中抗凋亡因子和促凋亡因子的比例失衡，来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡，促进其存活。（四）Ｗｎｔ３能够促使小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化，提示其可能参与了肝纤维化的发展进程。（五）HBx 能诱导肝前体细胞发生 EMT，并增强其迁移能力。（六）通过筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株HP14.5/HBx，探讨了HBx通过活化wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖和HBx能诱导肝前体细胞发生上皮—间质转化,并增强其迁移能力。（七）Ad-HBx能够有效感染Hp14-19并在细胞中表达，MTT结果显示HBx蛋白能够显著促进Hp14-19细胞增殖；FCM检测结果显示在Ad-HBx组S期细胞明显增加，且细胞凋亡率明显降低；感染 Ad-HBx细胞分化早期指标穿膜蛋白、肌酸激酶 19和甲胎蛋白表达降低减慢，而晚期指标 CK18 和白蛋白（Albumin，ALB）表达升高不明显。（八）在Ad-HBX/14-19细胞中，呈现细胞凋亡特征的细胞数量明显减少；结果显示细胞凋亡率降低；Bcl2 、mcl-1 在mRNA和蛋白表达量增高，而促凋亡因子Bax表达降低。（九）在Ad-HBX/14-19细胞中，t-GSK3β蛋白表达量相对对照组无明显差异，而 p-GSK3β蛋白表达量明显增加,β-catenin在mRNA和蛋白水平上均表达增高；在Ad-HBX组中β- catenin在细胞质中大量积聚，且有向细胞核