nanog对牙髓干细胞增殖分化的影响及信号通路调控

本课题组前期研究发现，体外培养牙髓细胞可表达Oct-4、Sox2等转录因子，牙髓细胞矿化过程涉及Wnt、Notch等信号通路的调控，推测在牙髓组织中表达的转录因子Nanog可能通过上游TGF-β/Activin信号通路对牙髓干细胞（DPSCs）的增殖分化进行调控。本项目通过构建Nanog基因过表达和沉默DPSCs模型，采用RNA干扰、免疫荧光、Realtime PCR、Western blot、基因芯片等方法，研究Nanog在体外培养人DPSCs中的表达规律；检测Nanog基因修饰DPSCs增殖、分化和细胞周期的变化，筛选下游靶基因的差异表达；探讨TGF-β/Activin信号通路对DPSCs表达Nanog的调控作用，以及对FGF、Wnt和BMP等信号通路的影响，以阐明TGF-β/Activin信号通路通过Nanog调控DPSCs增殖分化的机制，为Nanog在牙再生治疗中的应用提供依据。

为阐明TGF-β /Activin 信号通路通过Nanog 调控人牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs)增殖、分化的机制，自成人健康牙髓组织中分离培养人DPSCs，检测转录因子Nanog在牙髓细胞中的表达水平，观察其表达规律，结果表明：在牙髓细胞体外连续培养环境下，随着代数增加，Nanog表达量呈下降趋势，矿化诱导可降低Nanog的表达。采用慢病毒载体成功构建稳定过表达Nanog的牙髓细胞株，检测细胞增殖能力、多能性转录因子Oct4和Sox2的表达量以及细胞的多向分化能力，结果显示过表达Nanog可提高牙髓细胞的增殖能力，激活Oct4和Sox2的表达，增强细胞成牙本质、成脂等多向分化能力。采用不同浓度的TGF-β1、Activin A和 TGF-β/Activin信号通路抑制剂SB431542刺激牙髓细胞，检测刺激因子浓度对Nanog表达的影响，结果显示：TGF-β1和Activin A可促进Nanog的表达，SB431542则抑制Nanog的表达，说明牙髓细胞中TGF-β/Activin信号通路正性调节Nanog的表达。采用PI3K通路抑制剂LY294002处理牙髓细胞，发现PI3K/AKT信号通路可促进细胞的增殖和成牙本质向分化能力。组蛋白乙酰转移酶p300是多种转录因子激活基因表达的共激活子，为更深入了解Nanog对牙髓细胞增殖、分化的调控机制，本项目还构建了p300和p300 HAT缺失突变株（p300-ΔHAT）稳定过表达人牙髓细胞株，检测p300对牙髓细胞增殖及分化能力的影响，结果表明，过表达p300对牙髓细胞增殖能力无明显影响，但可增强牙髓细胞成牙本质向分化能力，HAT活性与p300该调控作用无直接关系。过表达p300可促进牙髓细胞中转录因子Nanog和Sox2的表达，HAT活性与其发挥调控作用密切相关，shRNA干扰p300则可抑制细胞成牙本质分化能力，说明p300可能通过促进牙髓细胞转录因子Nanog等的表达增加细胞分化能力。本项目的研究结果为转录因子Nanog 在牙再生治疗中的应用提供了依据。