茶树脂氧合酶基因家族成员的分离及其抗病调控机制的研究

脂氧合酶（LOX）是植物体内重要的催化酶，在植物生长发育过程、抵御病虫为害或机械损伤等生物和非生物胁迫反应中起重要作用。茶树脂氧合酶是由若干个成员组成的多基因家族，分布于不同的组织器官，具有不同的表达丰度和生理功能。.本项目拟分离克隆茶树脂氧合酶基因家族各个成员；利用DNA重组手段构建转LOX基因工程菌，研究脂氧合酶家族蛋白的不同生物学特性及催化产物的抗病防御相关功能；同时采用实时荧光定量PCR技术鉴定、检测茶炭疽病菌胁迫相关LOX基因及其表达差异，分析病害相关LOX基因表达调控与外源SA、JA等抗病反应信号分子诱导的相关性；从而揭示脂氧合酶基因家族在茶树抗病防御反应中的调控作用及机理。.本项目的研究对于丰富茶树抗病品种培育的基因资源库，加深茶树等林木抗病防御生理反应的分子机理认识，揭示茶叶香气形成的机理等具有重要理论和实践意义。

本项目的研究首先克隆得到了茶树脂氧合酶家族基因LOX1, LOX2, LOX3, LOX4 全长序列，在国际核苷酸序列数据库中登陆注册，基因检索号分别为：EU195885, FJ418174, FJ794853和HM370508。序列比对分析结果显示，LOX1和LOX4同源性较高，属于9/13-LOX基因亚家族，参与植物C6挥发物代谢和JA代谢途径，在脂肪族香气代谢过程和JA依赖型植物防御反应中具有重要作用；而另外两个成员 LOX2 和LOX3同源性较高，属于13-LOX基因亚家族，主要参与JA的代谢合成，与植物JA抗病防御相关。其次, 研究构建了4个体外表达茶树脂氧合酶基因的酵母表达载体：pPIC9K/LOX1、pPIC9K/LOX2、 pPIC9K/LOX3和pPIC9K/LOX4；分别转化毕赤酵母感受态细胞，成功获得4个转酵母基因工程菌株。工程菌经诱导发酵培养，高效表达了茶树脂氧合酶。随后的酶学特性研究表明：重组LOX1和LOX4分子量约98kDa，催化亚油酸反应最适pH分别为3.6和4.0，HPLC检测证明其催化产物中包含9-HPOD和13-HPOD；LOX2和LOX3分子量约102kDa，催化反应最适pH均为3.0，催化亚油酸主要形成了13-HPOD,是JA合成的上游直接底物。9-HPOs和13-HPOs均具有体外抑制炭疽病菌生长的作用,相比较9-HPOs抑菌效果较强。最后, 检测了不同逆境胁迫下茶树LOX家族基因的表达调控模式。定量PCR研究发现, 机械损伤可诱导4个LOX基因的上调表达; 2.5mM水杨酸(SA)处理,可诱导LOX2, LOX3和LOX4基因上调表达,但不诱导LOX1基因表达; 200μM茉莉酸甲酯(MeJA)诱导4个LOX基因均上调表达,其中LOX2和LOX3高水平表达。同时，定量PCR检测了4个LOX基因在茶炭疽病胁迫下的表达模式，其中LOX1、 LOX2和LOX4受炭疽病侵染诱导, 表达量上升；LOX3的表达受到病原菌侵染抑制。