茶树LOXs启动子序列的克隆及其在病虫胁迫下受WRKY类转录因子调控机制的研究

Jasmonate and it's precursors play important role in plant induced defenses against necrotrophic pathogens and herbivorous insects. In tea plant, the lipoxygenases (LOXs) involve in the JA biosynthetic pathway, and they are differentially regulated by tea pests including tea anthracnose, tea aphids and tea green leafhoppers. The regulation of LOXs is predominant in transcriptional level, by some transcription factors binding to the specific DNA-motifs in gene's promoters. In this project, we will first clone tea plant LOXs genes' promoters and the conserved catalyzing domains of WRKY transcription factors, and then analyze the characters of LOXs promoter including the potential DNA-motifs by bioinformatics software; secondly, we will generate and purify the anti-WRKYs antibody, and try to establish the chromatin immunoprecipitation (ChIP) technology in tea plants, and using ChIP to analyze the possibilities of WRKY transcription factors binding to the promoters of LOXs after different tea pests attack. Finally, we will try to figure out the mechanisms of LOX genes' expression and regulation by WRKY transcription factors in responding to different tea pest stresses. This project will not only help to understand tea plants defense mechanism against pathogens and insects, enrich the resource of tea plants defense related regulation elements, but also help to discover the new valuable tea resource.

信号分子茉莉酸JA及其前体物质都能介导植物对坏死型病原真菌和植食性昆虫为害的防御反应。茶树LOX家族基因参与JA的生物合成，受炭疽病、小绿叶蝉和茶蚜等病虫胁迫表达。由于胁迫方式的不同，茶树LOX基因具有不同的表达模式。LOX基因的表达调控主要是在转录水平，通过转录因子与启动子上特异DNA序列结合实现的。本项目拟克隆茶树LOX家族基因的启动子及WRKY类转录因子活性域序列；利用生物信息学软件分析LOX启动子上包含的DNA基序(DNA-motif)；同时制备抗茶树WRKY蛋白抗体；建立茶树染色质免疫共沉淀(ChIP)技术；并利用ChIP技术检测病虫胁迫下WRKY转录因子与茶树LOX启动子序列结合的特异性；从而揭示病虫胁迫下WRKY类转录因子调控茶树LOX家族防御基因表达的机制。本项目的研究对于探讨茶树抵御病虫胁迫的机制，丰富茶树抗病虫调控元件的资源库，发掘有利用价值的茶树新资源具有重要意义。

茶树防御相关的脂氧合酶家族基因的表达调控是本项目研究的重点。项目首先通过染色体步移技术分离得到了茶树CsLOX家族基因5’端的未知DNA序列(启动子序列)。其中获得CsLOX1基因启动子序列1794bp，CsLOX2基因启动子序列1120bp，CsLOX3基因启动子序列1188bp，以及CsLOX4基因启动子序列2001bp。利用PLACE、PlantCARE工具对CsLOX启动子上所含的顺式作用元件进行了在线预测，发现这些序列包含启动子核心元件如TATA-box、CAAT-box，以及多种类型的激素应答作用元件、生物或非生物胁迫响应相关的元件，以及逆境胁迫相关的转录因子结合元件等。特定的，我们发现CsLOX4启动子包含7个W-box和5个W-box like基序，其中10个DNA基序彼此串联、聚集成簇，这些串联成簇的W-box表明该区域是WRKY类转录因子识别区域，而CsLOX4是潜在的WRKY调控靶基因。其次，根据植物WRKY类转录因子蛋白序列的保守区域设计兼并引物，克隆获得茶树WRKY家族基因，进一步通过RACE技术获得了茶树12个WRKY蛋白序列，序列分析表明这些序列都包含能识别并结合W-box的WRKYGQK区域。随后的定量PCR分析表明，CsWRKY家族基因参与茶树与茶病害（炭疽病菌）、茶树与虫害（茶尺蠖、茶小绿叶蝉）等互作，其中CsWRKY3基因参与了上述不同的互作。我们进一步在体外表达了CsWRKY3基因，并制备了抗体，用于检测茶树WRKY蛋白的表达以及分析茶树WRKY蛋白与靶基因启动子区域的互作。再次，根据已有的研究报道，我们探索并建立了适宜茶树染色质免疫共沉淀的技术，用于分析茶树蛋白与DNA体内的互作机制。最后，利用染色质免疫共沉淀技术检测了茶树在炭疽病危害、茶尺蠖或茶小绿叶蝉胁迫下，茶树WRKY转录因子与CsLOX4启动子的互作特性。结果发现茶炭疽病侵染后，茶树CsWRKY3基因表达，CsWRKY3蛋白结合在CsLOX4基因的启动子上，调控该基因的表达，进而参与茶树与病原菌的分子互作；另外，茶尺蠖及茶小绿叶蝉为害也能诱导茶树某些CsWRKY基因的表达，这些CsWRKY蛋白结合在CsLOX4启动子上，调控目的基因的表达。本项目的研究揭示了茶树受病虫胁迫后，CsWRKY类转录因子调控茶树防御相关基因CsLOX4的表达，进而激活下游防御反应。