联合运用Dam甲基转移酶及高通量测序对哺乳动物染色质开放程度进行高分辨率检测

Chromatin accessibility is critical for many fundamental biological processes. Because of invasive nature of nuclease, available methods measuring chromatin accessibility can only focus on the most open chromatin regions, therefore can not discriminate moderate open regions and the majority of dense chromatins. New methods are needed to overcome these limitations. In this project, in vitro treatment of nuclei with Dam methyltransferase followed by methylation-specific restriction enzyme are combined to establish a new technology named DamRE-seq, by which not only accessibility of open chromatins but dense chromatin could be measured in a genome-wide scale. Based on DamRE-seq, we plan to validate the stimulation of high-order dense chromatin to the activity of PRC2 at the genome wide level. By integrating our DamRE-seq data to existing epigenomic data, genome will be annotated by the accessibility and combination of epigenetic factors. In the end, dynamics of chromatin accessibility during RA-induced differentiation of ES cells will be measured to study the relationship between chromatin accessibility and cell fate transitions.

染色质开放程度的调节是诸多重要生物过程进行的基础。目前已有的基于核酸酶的敏感性检测方法由于对染色质的破坏性，仅能发现最开放的一小部分区域，无法在全基因组水平上清晰地区分不同染色质区域的开放或致密程度，亟需建立一套新的方法来研究哺乳动物染色质的开放程度。我们试图联合利用Dam甲基转移酶和针对甲基化位点的限制性内切酶的处理，通过高通量测序得到Dam修饰过的区域的信号强弱，从而得到所在染色质的开放程度。此技术（DamRE-seq）在保持染色质高级结构的同时，在较大的动态范围上测出了染色质开放程度，具备清晰区分更多染色质区域开放程度的能力。基于DamRE-seq，我们计划在细胞内验证致密染色质对PRC2活性的激活作用，这将提供高级染色质致密结构激活PRC2并导致基因沉默的细胞内证据。另外，我们也对RA诱导的ES细胞定向分化的不同阶段进行染色质开放程度的检测，以期发现分化过程中的染色质的动态变化。

本项目的拟定研究计划为利用DNA修饰6mA的修饰酶，对基本不存在此修饰的哺乳动物细胞进行处理，再利用修饰的多少和分布来研究染色质的开放程度。随着本研究的进行，领域内ATAC-seq得到了长足的发展和应用，使得研究染色质的开放程度成为了易行且强有力的研究手段。另一方面，本项目预期的利用第三代高通量测序技术对6mA修饰进行碱基分辨率的检测技术却没有能够发展成熟，目前尚无国内测序服务公司能完成6mA的DNA修饰的三代测序。这使得本研究计划的单碱基分辨率的目标难以达成；主要基于以上两点考虑，本项目将研究计划进行了调整，取得了一定的研究成果。一，基于小分子化合物库的筛选，得到LX-3/LX-4/LX-5三种全新的化合物，这三种化合物能够不依赖于去甲基化地激活甲基化抑制的基因的转录。进一步的研究发现，这三种化合物能够激活MAPK通路及其下游的转录因子。这个发现提供了能够激活MAPK通路的新的工具化合物，并发现NFkB等MAPK下游转录因子可以克服甲基化DNA的阻碍导致基因的转录激活。二，发现TNFa处理能够激活下游的NFkB转录因子，转录因子能够激活被DNA甲基化所抑制的基因，而长期的处理能够导致进一步的DNA去甲基化。这个去甲基化是依赖于TET2的主动去甲基化，这个去甲基化状态会长时间的维持，并在第二次TNFa处理时导致更高的激活效应。这种“记忆效应”可能是炎症反应导致去甲基化并进一步导致原癌基因的激活，或者导致重复序列元件转位的激活，最终导致癌症的机制之一；也可能是免疫系统中记忆B细胞和记忆T细胞中“记忆”的表观遗传学机制，值得进一步研究。三，Ash1是重要的Trithorax家族蛋白，在拮抗Polycomb家族蛋白的抑制作用中起着重要作用，是调控发育过程如HOX等重要基因的关键表观遗传因子。但由于Ash1的蛋白分子较大，多年来一直没有其复合体的研究报道。本研究首次鉴定了其复合物两个重要的组分Mrg15和Nurf55，并阐明了Mrg15对Ash1的调节作用，还在果蝇体内做了系统突变的影响机制的研究。本工作是Trithorax家族蛋白研究领域的重要组成部分。