高通量测序技术用于早期快速检测耐药结核的研究

The emergence and spread of drug-resistant tuberculosis (TB) is the most difficult problem for the control and prevention of TB disease worldwide，and early diagnosis and effective treatment is the key point for cure of drug-resistant TB. However, due to the weakness of conventional drug susceptibility testing (DST) and existing molecular biology methods, there is no method available for the early and rapid detection of drug-resistance for multiple anti-TB drugs. High-throughput sequencing technology enables to sequence thousands of DNA fragments in parallel and has advantages of high throughput and high speed. In the present study, we will develop a novel high-throughput sequencing method for early and rapid detection of drug-resistant TB in China. We select 20 drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains based on DST results, and sequence ten genes related to first- and second-line drug resistance using high-throughput sequencing. Furthermore, we will optimize the high-throughput sequencing method to make it suitable for early and rapid detection of drug-resistant TB. Finally, we will validate the established method and evaluate its application potential in 100 clinical TB strains and 100 smear-positive sputum samples by comparison with conventional DST. The new method will provide invaluable theoretical and practical value for early diagnosis and personal therapy of patients with drug-resistant tuberculosis in China.

耐药结核病的出现和蔓延已成为全球结核病防治工作的难点，早期诊断和尽早实施有效治疗是成功治疗耐药结核病的关键。但是，由于传统药敏试验和现有分子生物学方法的缺陷，目前尚缺乏能够对多种抗痨药物耐药性进行早期快速检测的方法。高通量测序技术能够同时对成千上万条DNA序列进行平行测序，具有通量高、速度快等优点。本课题拟通过传统药敏方法筛选出20株耐药结核菌株，利用高通量测序技术对这些菌株的十个耐药相关基因进行序列分析，在此基础上建立针对一线和二线抗痨药物耐药基因的高通量测序方法，进一步通过优化方法使其适合于我国耐药结核病患者的早期快速检测。通过检测100株结核分枝杆菌临床分离株和100例涂片阳性的痰标本对高通量测序法进行验证，探讨其作为分子药敏检测方法的应用价值，从而为我国耐药结核病患者的早期诊断及个体化治疗提供更为有效的检测手段。

耐药结核病的出现和蔓延已成为全球结核病防治工作的难点，早期诊断和尽早实施有效治疗是成功治疗耐药结核病的关键。但是，由于传统药敏试验和现有分子生物学方法的缺陷，目前尚缺乏能够对多种抗结核药物耐药性进行早期快速检测的方法。高通量测序技术能够同时对成千上万条DNA序列进行平行测序，具有通量高、速度快等优点，有应用于临床早期快速检测多种抗结核药物耐药性的潜力。本课题通过传统药敏方法筛选出了20株耐药结核菌株，利用高通量测序技术对这些菌株的十个耐药相关基因进行序列分析，在此基础上建立了针对一线和二线抗痨药物耐药基因的高通量测序方法。进一步通过方法优化和再验证，确定了高通量测序的各项指标：最低起始模板浓度为1ng，低频突变最低检出限为10%，即起始模板浓度高于等于1ng和突变频率大于等于10%的可以检出。在结核分枝杆菌临床分离株的检测中，以DST为金标准，高通量测序方法对所有药物的检测灵敏度均高于75%，特异度均高于90%，可作为潜在的分子药敏检测方法应用于临床。在对临床痰标本的检测中，以DST为金标准，高通量测序法对所有药物的检测灵敏度均高于65%，特异度均高于90%。提示我们高通量测序方法对于从痰标本中快速检测结核分枝杆菌对主要一线和二线药物的耐药性具有很好的应用价值和前景。此外，我们基于本课题的研究结果，对于现有TB诊断和耐药诊断方法GeneXpert进行了诊断效能的meta分析，并评估了GeneXpert诊断儿童耐药结核病的可靠性，分析我国XDR-TB一线药物和二线药物的主要耐药情况。