非甲基化DNA结合蛋白BEND3在染色质高级结构中的功能研究

The regulation of high order structure of mammalian chromatin is critical for many important biological functions. A few known chromatin architecture proteins can only partially explain chromatin high order structure on a limited extent, which makes it necessary to identify new key players and elaborate their functions. We’ve identified BEND3 as a novel unmethylated DNA binding protein and found it’s mainly localized within unmethylated CpG islands in our early work. Co-crystal structure of key domain of BEND3 and its binding motif shows BEND3 can form dimer which thereafter binds to two copies of DNA motifs. This suggests that BEND3 potentially interacts with two distal CpG islands and mediates long range promoter-promoter interactions. In this project, we are planning to systematically study the mechanisms of the recognition of BEND3 for unmethylated DNA, the relationship between BEND3 binding and chromatin states, and especially the role that BEND3 plays in the regulation of chromatin high order structure during ES cell differentiation.

在高等哺乳动物中，染色质的高级结构及其动态调节对很多关键生物功能的正常行使具有重要的作用。目前已知的影响染色质高级结构的染色质架构蛋白数量不多，且只能从一定程度上部分地解释染色质的结构和动态变化，亟需发现新的染色质架构相关的调控蛋白。我们发现BEND3可以特异地与非甲基化DNA结合，并通过预实验发现其主要结合在基因组的CpG岛区域。进一步解析BEND3关键识别结构域和DNA的共结晶蛋白结构，我们发现BEND3可以二聚体形式存在并同时结合两分子的DNA序列。这提示我们BEND3很可能同时结合两个远距离的CpG岛，介导多基因的启动子-启动子相互作用。本项目计划系统地研究BEND3结合非甲基化DNA的生化及结构机理，分析BEND3结合染色质与染色质状态的相互关系及其对基因转录的影响，重点研究BEND3对胚胎干细胞诱导分化过程中染色质相互作用的动态调节，阐明BEND3在染色质高级结构中的功能。

我们在早期的研究项目里发现BEND3蛋白偏好结合非甲基化的DNA。基于这个发现，我们通过ChIP-seq研究了BEND3蛋白在基因组上的结合分布；通过蛋白质晶体结构学方法，确定了BEND3的BEN4功能域和结合DNA序列的共结晶的结构。重要的是，我们研究了BEND3敲除后小鼠胚胎致死的机制，检测了敲除的胚胎干细胞的转录谱的变化，染色质表观修饰的变化，以及在随后发育阶段的转录谱和表观遗传修饰图谱。通过对BEND3的功能研究，发现BEND3在基因组中主要分布在启动子和增强子的CpG岛区域，即主要在转录调控区。通过ChIP-seq的数据分析，我们确定了BEND3的结合序列，并通过蛋白质晶体学确定了BEN4功能域和DNA的共结晶结构。通过结构生物学得到的信息，我们也在体外突变实验验证了关键氨基酸对非甲基化DNA的识别特异性。重要的是，BEND3敲除的小鼠是胚胎致死的，说明BEND3在胚胎发育中起着关键的作用。进一步的研究发现，BEND3敲除后的胚胎干细胞发育时，尤其是发育到第三天的时候，bivalent基因的表达发生了明显的上调，说明BEND3在防止bivalent基因的过早激活方面行使功能。Bivalent基因是发育过程中待激活的一群重要基因，其调控机制和关键因子尚待阐明。本项目通过系统地研究BEND3结合CpG岛并调控bivalent基因转录的功能，是领域内第一次发现防止bivalent基因过早激活的调控因子。另外，CpG岛是基因转录重要的调控区域，已有报告例如BANP蛋白结合在活跃转录基因的CpG岛并维持其转录活跃状态，但bivalent基因的CpG岛的功能未知。这项工作首次阐明了CpG岛结合蛋白BEND3在bivalent基因的调控功能，也进一步阐明了bivalent基因的身份特征。