基于TGF-β1介导的Smads和ERK信号通路在肝纤维化过程中的交互对话及疏肝健脾活血方的干预机制

Hepatic fibrosis is damage-repair mode in the pathological process of Chronic liver damage. After HSC activation is the key of the abnormal expression of ECM. In the process of proliferation and activation on HSC and synthesis on ECM , TGF-β1 is considered to be the most critical factor.Study found ERK pathway mediated by TGF-β1 closely related to fibrosis, and possibly cross talk with Smads signaling pathways . But the mechanism is not yet fully clear.The point about this project is the interactions of TGF-β1/Smads/ERK signaling pathways in hepatic fibrosis. Dynamic observing the interactions of TGF-β1 /Smads / ERK signaling pathways in hepatic fibrosis in rats and the anti-fibrotic molecular mechanism of shuganjianpihuoxue recipe in those processes; observing the regulate and control of Smad4 small interfering RNA and ERK blocking agent on signal transduction induced by TGF-β1 and the anti-fibrotic molecular mechanism of serum containing of shugan jianpihuoxue recipe in those processes. To definite the interactions of TGF-β1/Smads/ERK signaling pathways in the process of hepatic fibrosis and reveal the target or link on shuganjianpihuoxue recipe against hepatic fibrosis. Providing new research approaches and methods for prevention and treatment of liver fibrosis research on TCM.

肝纤维化是慢性肝损伤病理过程中的损伤-修复模式，其发生的关键是HSC活化后ECM的异常表达。在 HSC 增殖、活化及合成 ECM 的过程中，TGF-β1被认为是最关键的因素。研究发现 TGF-β1介导的 ERK 通路与肝纤维化关系密切，并可能与 Smads信号通路存在交互对话，但机制尚未完全明确。本项目以TGF-β1介导的Smads、ERK信号通路在肝纤维化过程中的相互关系和作用为切入点，体内动态观察大鼠肝纤维化形成过程中TGF-β1/Smads /ERK 信号通路的相互作用及疏肝健脾活血方的干预作用；体外观察Smad4小分子干扰RNA和ERK通路阻制剂对TGF-β1信号传导的调控及疏肝健脾活血方含药血清的干预作用，以明确肝纤维化过程中TGF-β1介导的Smads、ERK 信号通路之间的相互关系，揭示疏肝健脾活血方抗肝纤维化的靶点或环节，为中医药防治肝纤维化提供新的研究思路和方法。

肝纤维化是肝细胞发生坏死和炎性刺激时，肝脏内以Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维为主的细胞外基质弥漫性过度增生、沉积发展成肝硬化的病理过程。TGF-β是促进HSCs激活和导致肝纤维化作用最强的细胞因子，它主要通过TGF-β/Smads途径促进HSCs激活，HSCs在其作用下活化收缩，从而促进肝纤维化的发展。但TGF-β1／Smads并非是HSC激活的唯一通路，TGF-β1活化的ERK通路参与了HSC的激活、增殖、凋亡过程，促进肝纤维化的发生发展。本课题采用四氯化碳成功复制大鼠肝纤维化模型，疏肝健脾活血方由桃仁、桂枝、制大黄、甘草、香附、白术、莪术、鳖甲、参三七、茯苓、丹参、红枣等组成，研究结果表明该方可以改善CCl4大鼠肝纤维化程度，对肝纤维化具有防治作用；疏肝健脾活血方高中低剂量组中TGF-β1、p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白的表达均有不同程度的下降，且高剂量组TGF-β1、p-Smad2/3的表达下降优于其他组，表明疏肝健脾活血方可能通过降低TGF-β1蛋白的表达，Smad2/3和ERK1/2蛋白的磷酸化来发挥抗纤维化的作用。研究发现，Smad7基因属于即刻反应基因，在肝纤维化早期，作为抑制信号反应性升高，后期通过某种机制对肝纤维化的发展失去负反馈抑制。而疏肝健脾活血方发挥抗纤维化的机制可能和具有增强Smad7负反馈调节的作用有关。体外实验部分通过采用TGF-β1诱导HSC-T6，利用RNAi技术敲除Smad4基因，进而阻断大鼠肝星状细胞内TGF-β1介导的Smads信号通路；应用MERK抑制剂PD989059抑制MERK/ERK信号的表达，阻断TGF-β1介导的ERK信号通路，实验结果表明疏肝健脾活血方可以干预TGF-β1介导的Smads和ERK两条信号转导通路中关键信号分子的表达,抑制Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表达，p-Smad2/3、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达，增强Smad7负反馈调节的作用，阻止肝纤维化进程中的信号转导,减少I型胶原蛋白的表达从而发挥较好的抗肝维化作用。