结核分枝杆菌中Pup-蛋白酶体系统对毒素-抗毒素系统功能的调控

结核分枝杆菌中存在原核类泛素蛋白(Prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup)，Pup共价标记多种功能蛋白，并介导被标记蛋白通过蛋白酶体降解，Pup-蛋白酶体系统揭示了一个崭新的原核蛋白降解机制。结核分枝杆菌基因组上存在多个毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin,TA）系统，其中的毒素蛋白参与应激条件下的细菌生长抑制，与结核菌的持留相关。毒素蛋白对蛋白酶不敏感，目前对毒素蛋白的降解机理缺乏了解。我们的前期研究发现共表达Pup可以导致毒素蛋白Rv2801c的降解，这种降解作用在营养缺乏时被减弱。毒素蛋白降解是TA系统功能调控的重要环节，本项目中我们将针对多个TA系统，鉴定其中的毒素蛋白是否是Pup的靶蛋白，阐明毒素蛋白降解的分子机理，揭示不同生长条件下Pup-蛋白酶体系统对TA系统功能的动态调控，深入认识Pup-蛋白酶体系统在结核菌生长调控中的作用。

本项目旨在揭示Pup-蛋白酶体系统对毒素-抗毒素系统的调控，探讨Pup-蛋白酶体系统在应激条件下分枝杆菌生长调控中的作用。我们主要完成了以下4个方面的工作：.1. 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的鉴定.MazEF是细菌基因组上广泛存在的毒素-抗毒素系统。我们的研究表明，在结核分枝杆菌的7个MazF同源蛋白中只有Rv1991c、Rv2801c、Rv1102c和mtPemK是毒素蛋白，且与其上游基因构成毒素-抗毒素系统，其中Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c通过切割mRNA发挥毒素蛋白的作用，但mtPemK不具有RNA内切酶的活性，可能通过抑制细菌的胞质分裂来发挥作用。.2. Pup-蛋白酶体系统的研究.我们分别构建了Pup、PafA、Dop或蛋白酶体亚基敲除的分枝杆菌菌株；表达纯化Pup、Dop和PafA等蛋白，构建了蛋白Pup化体外鉴定体系；在大肠杆菌中共表达PafA和PupE，构建了蛋白Pup化体内鉴定系统；发现PafA可以通过催化自身的多Pup化进行Pup-蛋白酶体系统的自我调控。.3. Pup-蛋白酶体系统对毒素-抗毒素系统的作用.我们的研究表明，耻垢分枝杆菌MSMEG_5635/MSMEG_5634系统中的抗毒素蛋白MSMEG_5635能被单Pup化，K6、K17或K24都可以是Pup化修饰位点。结核分枝杆菌Rv1991a-1991c和Rv1103c-1102c系统中的毒素和抗毒素蛋白均不能被Pup化；mtPemI-mtPemK系统中的毒素蛋白mtPemK可以被单Pup化，Pup化位点在K16或K64；Rv2801a-2801c系统中的抗毒素蛋白Rv2801a能被单Pup化，Pup化位点在K2，但毒素蛋白Rv2801c可以在多个位点被Pup化，而且共表达Pup可以显著降低Rv2801c毒素蛋白对分枝杆菌的生长抑制作用。.4. Pup-蛋白酶体系统在应激条件下的分枝杆菌生长调控中的作用.我们的研究发现:1）在对数生长期耻垢分枝杆菌中蛋白的Pup化水平较低，进入静止期时显著升高；2）负责清除过氧化氢的关键酶KatG、SodA和AhpC均可被Pup化，敲除Pup-蛋白酶体系统相关基因能增强耻垢分枝杆菌对过氧化氢的耐受能力；3）敲除Pup-蛋白酶体系统相关基因导致耻垢分枝杆菌对热激敏感。这些结果表明Pup-蛋白酶体系统参与应激条件下的分枝杆菌生长调控。.