亚基界面/末端构筑盐桥和二硫桥强化多亚基酶稳定性

Stability intensification of multimeric enzymes is a key issue and common urgent requirement in the industrial biocatalysis. Based on the basic principle of enzyme structure and "Short-Board Effect", strong interactions (salt-bridge/disulfide-bridge) should be introduced into the "short board" region that limiting the enzyme performance to effectively enhance the enzyme stability. It's revealed that the terminus and interface of subunits are the two key "short board" regions initiating enzymes' inactivation in the multimeric enzymes. A new idea is presented to design circular peptide tags bridged by salt-bridge/disulfide-bond bridge into the subunit terminus of the model enzymes (Nitrile hydratase, Cephalosporin C acylase, etc) to universally intensify the stability. The disulfide bond formation in the subunit interface is especially highlighted. The formation mechanism, regulation factors and basic effects of disulfide-bridge in the recombinant enzymes are emphasized. The intra-cellular environment modification for disulfide bond formation will be also focused. It's expected the results in this project can generate a new breakthrough for the development of biocatalysis.

针对多亚基酶稳定性改造的迫切需求和共性问题，从热失活构象变化基本规律和"木桶"原理出发，提出肽链末端和亚基间界面是多亚基酶结构不稳定性的"短板"区域。针对上述区域进行改造，可在不损失酶活条件下显著提高酶的稳定性。针对亚基末端区域，提出了设计具有独特自回转盐桥/二硫桥结构的通用环肽标签模块、插入不同模式酶（双亚基腈水合酶、头孢菌素C酰化酶等）的N-、C-或N/C-末端，通过刚性"双桥"作用铆定阻止肽链末端的起始伸展失活，普适性地提升酶的稳定性的新思路。针对亚基界面，探索亚基间二硫键设计与构建的方法和基本规律；采用分子动力学模拟和"盐桥"网络分析辅助设计"二硫桥"的新思路，不依赖于嗜热酶结构，直接设计构建亚基间界面二硫桥，研究亚基间"双桥"作用提升酶稳定性的方法和规律。进一步发现和明确红球菌细胞内微环境下二硫键形成的调控因素、基本规律和效果，为生物催化科学发展提供思路和方法上的新突破。

针对工业生物催化多亚基酶稳定性改造的迫切需求和共性问题，从热失活构象变化基本规律和“木桶”原理出发，提出肽链末端和亚基间界面是多亚基酶结构不稳定性的“短板”区域。对上述区域进行改造，可在不损失酶活条件下显著提高酶的稳定性。采用分子动力学模拟，基于离子键盐桥，设计了亚基末端拟环肽标签，优化了盐桥标签长度和结构，研究了拟环肽盐桥标签对酶的活性和稳定性的影响；进一步将盐桥标签引入腈水解酶、CPC酰化酶等分子，考察了末端盐桥标签改造方法的普适性。建立了亚基界面间二硫键的设计方法，成功构建了腈水合酶盐桥—二硫键“双桥”改造腈水合酶；探索了细胞内氧化态微环境和氧化剂对二硫键形成的影响。研究了盐桥和“双桥”改造腈水合酶的活性、稳定性变化规律。还研究了红球菌分子伴侣对酶活性和稳定性的影响规律，提出了以红球菌为宿主平台、高活性、高稳定性表达腈水解酶、环氧化物水解酶等其它功能酶的新策略。进一步解析了红球菌特殊的菌落分型现象，解决了红球菌大规模发酵过程中的絮凝问题；建立了红球菌CRISPR-Cas9基因组编辑方法，为红球菌胞内氧化态微环境的调控奠定了基础。其中，设计的（GXPXG，X为带电氨基酸）拟环肽盐桥标签在腈水合酶α亚基C末端的插入提高了酶的活性和稳定性。表达末端盐桥改造腈水合酶的重组红球菌TH7催化生产丙烯酰胺时，副产物丙烯酸下降55%，细胞使用批次可从6次提高到10次。表达“双桥”改造腈水合酶的重组红球菌TH8，热稳定性和丙烯酰胺耐受性分别为改造前的2.35倍和2.12倍；在30吨水合釜中成功实现了连续3批次水合生产约500g/L高浓丙烯酰胺。截至2018年底，已发表SCI期刊论文7篇，中文期刊论文1篇；培养博士后2人，研究生8人；新申请中国发明专利4项，已授权1项。圆满完成了各项预期研究指标。本项目产生的专利技术已在两家生产企业实施。产业化总利润约5.4亿元，税收约3亿元。获2017年教育部高校科学研究优秀成果技术发明二等奖（第1完成人）及2016东营市科学技术合作奖。