I类透明质酸合成酶催化能域快速收敛定位与解析

透明质酸是一种重要的功能产品，在医疗、保健和化妆品等领域都具有广泛应用。透明质酸合成酶是一种膜蛋白，是合成透明质酸的核心酶。它可以同时实现两种不同单体底物分子的结合、两条延伸HA链段的结合、两种底物分子的糖基转移活性以及HA产物链的过膜转运等7种不同的功能，但具体催化功能域的活性基团、模体结构、位置与催化机制等都尚未解析，是迄今为止最神秘的蛋白酶之一。本项目面向透明质酸合成酶的催化功能域解析，提出"大区间→小区间→模体/位点"快速收敛定位的新思路，采用巧妙的基因末端渐短截取的新方法，系统、高效地定位与解析透明质酸合成酶的底物结合、催化中心及产物转运功能域，初步揭示其催化机制，获得原创性的新发现。进一步通过严谨的突变体酶学性质分析和HA-Sepharose凝胶－模体肽段特异结合实验来验证研究结果。本申请将为其它糖基转移酶和穿膜蛋白的类似研究提供良好的科学基础和方法借鉴。

透明质酸合成酶（HAS）是一种膜蛋白，是合成透明质酸（HA）的核心酶。它可以同时实现两种不同单体底物分子及两条延伸HA链段的结合、两种底物分子的糖基转移活性以及HA产物链的过膜转运等7种不同的功能，但具体催化功能域的活性基团、模体结构、位置与催化机制等都尚未解析。通过巧妙设计的区间→位点快速收敛定位的新思路和基因末端渐短截取的新方法，在对来源于S. equisimilis的SeHAS重新设计合成了大肠杆菌密码子偏爱性基因的基础上，设计突变了新的组成型启动子，实现了一系列截短SeHAS的表达；以HA产量、分子量（Mw）、HAS酶活和细胞密度为指标进行考察，成功发现了含有催化关键位点的四个重要区间：74-167 aa, 234-290 aa, 290-300 aa和409-417aa。进一步以hasA-hasB共表达高产体系为对象，通过序列比对和大量的定点突变，在上述四个区间发现了14个催化必需残基，分别属于74-YNE-76等6个模体域。提出了延伸中的HA链可能通过与SeHAS中B-rich motif结合从而实现跨膜“行进”和转运的新概念。基因截短和突变实验证实了C-末端一个motif对HA合成的重要作用。在SeHAS的6个B-rich motif中，选择2个为模式肽段进行定点突变，发现两个肽段中多数带正电的氨基酸残基都是SeHAS催化功能的关键位点。最后，通过设计水溶液中B-rich motif肽段与HA结合的沉淀实验以及HA-聚丙烯酰胺凝胶截留实验，得到了HA与B-rich motif多肽结合作用的定性与半定量描述。初步揭示了HA链在HAS内部“步移行进”、并最终分泌出胞外的机制。其中，还在一个B-rich肽段中发现了导致SeHAS酶活显著下降的负电氨基酸残基，是关键的功能位点之一。提出了SeHAS可能具有双催化活性中心。还通过转录因子突变强化了SeHAS表达和HA的合成，研究了SeHAS在谷氨酸棒杆菌中的重组表达，为腈水合酶、头孢菌素C酰化酶等生物酶的结构与功能研究提供了方法借鉴。