基于盐桥构建改善淀粉分支酶热稳定性的分子基础研究

The 1,4-α-glucan branching enzymes (GBEs) are important enzymes in enzymatic modification of starch. However, most of GBEs have low thermostability, which limits their industrial application. Therefore, it is important to improve the thermostability of GBEs. Salt bridges are able to significantly increase structural strength of amylases, which is an important force to stabilize amylases. Thus, construction of additional salt bridges is an effective way to enhance the thermostability of GBEs. The bottleneck to achieve this goal is the lack of strategies for introducing salt bridges at important sites in amylases and understanding of the crystal structures of GBEs. In order to overcome this problem, firstly, the investigation of the spatial distribution and evolutionary characteristics of salt bridges during evolutionary process of proteins will be carried out, revealing the discipline of formation of salt bridges. Secondly, solve the crystal structure of GBE and point out crucial sites in GBE. In addition, with combination of bioinformatics analysis and molecular dynamics simulation, the effects of additional salt bridges on the stability of GBE will be elucidated. Finally, a set of simple and feasible strategies to improve the thermostability of GBEs will be established, providing a foundation for enhancing thermostability of other amylases.

淀粉分支酶是酶法改性淀粉的重要用酶，然而，该酶热稳定性较差是限制其工业化应用的主要因素。因此，着力于提高淀粉分支酶的热稳定性显得尤为重要。淀粉酶内盐桥可以显著增加酶结构的紧密性，是一种稳定淀粉酶结构的重要作用力。因此，在淀粉分支酶内理性构建盐桥是提升其热稳定性的有效途径。但目前为止，缺乏在淀粉酶重要位点处引入盐桥的策略和缺少对淀粉分支酶晶体结构的了解限制了该途径的实施。为了解决这些问题，首先，通过对数据库中淀粉酶内盐桥在空间结构中的分布(外在表现)和进化过程中所具有的特征(内在特征)进行研究，揭示淀粉酶内盐桥的形成规律；其次，解析淀粉分支酶晶体结构并选择重要氨基酸位点以构建分子内盐桥。此外，通过生物信息学分析结合分子动力学模拟，以“动静”结合的手段，分析该酶内盐桥对酶结构稳定性的影响。最终，建立改善淀粉分支酶热稳定性的有效策略，提升该酶的热稳定性，并为其他淀粉酶热稳定性的改造提供借鉴。

淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme; GBE; EC 2.4.1.18)是属于糖苷水解酶家族13 (GH13)或糖苷水解酶家族57 (GH 57)的一类糖基转移酶，其可以催化淀粉在原主链上形成新的α-1,6-分支点。在淀粉分支酶改性淀粉过程中，淀粉分子中精细结构的变化是淀粉分支酶作用淀粉累计的结果，需要淀粉分支酶在较长的时间和较高的温度下作用于淀粉，累计达到改性原淀粉中α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键含量的作用。这一改性过程要求淀粉分支酶具有较高的热稳定性。然而，大部分来源的淀粉分支酶热稳定性较差，成为了制约淀粉分支酶工业化应用的因素之一。因此，有必要深入分析淀粉分支酶的序列和结构信息，结合生物信息学手段，深入挖掘影响淀粉分支酶热稳定性的内在和外在因素，并通过改善淀粉分支酶的内在、外在环境，提高淀粉分支酶的热稳定性，扩展淀粉分支酶的工业化应用。本项目以来源于Rhodothermus obamensis的淀粉分支酶晶体结构为模板，构建来源于Geobacillus thermoglucosidans的淀粉分支酶晶体结构，并探究了其理化性质，发现了静电相互作用对其热稳定性的影响显著。其次，通过生物信息学分析和统计学方法对蛋白分子中的盐桥分布特性进行分析，总结出适用于在蛋白分子内构建盐桥的基本规律。依据蛋白分子中盐桥的生物信息学特征，在淀粉分支酶分子中筛选出符合盐桥形成条件的氨基酸残基位点，并构建了一系列旨在提高淀粉分支酶热稳定性的盐桥突变体。强化了盐桥所处区域的稳定性并增强了淀粉分支酶的耐热性，并对相关机理进行了分析，获得了一种提高酶蛋白热稳定性的策略。