新型尿素诱导启动子调控机制及其进化和适用性规律

Inducible promoters are one of core tools to achieve overexpression of the target functional genes. Contradiction between the inducing effect and inducer cost of the inducible promoters is always key problems hindering their wide applications in engineered strains for scaled-up process. Starting from the major demand of the industrial biocatalysis, this project highlights to develop a novel urea-induced strong promoter with the features of low-cost, high efficiency and flexible controllability. The said promoters were identified as the ones driving the expression of nitrile hydratase and amidase in Rhodococcus ruber TH3. Based on genome analyses and transcriptome analyses, the regulation mechanism of the urea-induced promoter will be revealed by PICh, DNA fluorescence labeling, gene knockout and overexpression, gel retardation analyses and DNA footprinting analyses, coupling with bioinformatics prediction. The DNA sequences of regulator, operator and promoter core region will be determined and the interaction of different transcriptional regulation elements will be focused. Evolvability of the urea-induced promoter is also emphasized to ensure its effectiveness and gradient driving strength. The general applicability of this novel promoter in other model host bacteria, such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, will be also explored.

诱导型启动子是实现功能基因高效表达的核心工具之一。从工业生物催化重大需求出发，针对重组菌株改造和规模化过程中诱导型启动子的诱导效果和诱导剂成本之间的矛盾，致力于解析和发展廉价、高效、可控的全新启动子—尿素诱导启动子。以红球菌R. ruber TH3中受尿素严格诱导调控的腈水合酶/酰胺酶强启动子为研究对象，基于基因组和转录组测序，采用PICh实验、DNA荧光标记、基因敲除和过表达、凝胶阻滞和DNA足迹分析等方法，系统解析尿素诱导启动子的调控机制，原创性发现其调控蛋白、操纵序列和核心序列结构特征，探究其各诱导元件之间的相互作用规律。进一步对尿素诱导启动子的可进化性和普遍适用性进行研究，通过启动子核心区、操纵序列、调控蛋白结合区等重要位点的碱基突变，探究尿素诱导启动子强度的可控调变方法及其在典型异源宿主（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）中的适用性规律，为各种高产工业菌株的构建奠定科学基础。

诱导型启动子是实现功能基因高效表达的核心工具之一。从工业生物催化重大需求出发，针对重组菌株改造和产业化应用过程中诱导型启动子的诱导效果和诱导剂成本之间的矛盾，致力于解析和开发廉价、高效、可控的全新启动子。以红色红球菌TH3中受尿素严格诱导调控的腈水合酶/酰胺酶强启动子为研究对象，主要开展了红色红球菌启动子核心区特性、可进化性以及尿素诱导启动子调控元件和作用机制的发现及解析研究，探索了尿素诱导启动子强度调变方法及其在典型异源宿主中的适用性。原创发现了红色红球菌启动子核心区的序列特征和变化规律，实现了核心元件的进化改造，阐明了其可进化性并获得了梯级强度启动子小库。基于基因组、转录组分析和首次成功建立的红色红球菌CRISPR-Cas9基因编辑新方法，首次发现了尿素诱导启动子的负调控蛋白NhhD、AmiE和操纵序列。进一步通过多基因迭代敲除、过表达报告基因谱与分子相互作用分析，阐明了NhhD、AmiE和正调控蛋白NhhC与操纵序列和诱导剂分子的作用规律，提出了红色红球菌尿素诱导启动子的调控机制。进一步在大肠杆菌宿主中探究了其普适性拓展应用的可行性。还针对几种重要的工业宿主菌（红色红球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌），开展了新启动子发现与高强度人工启动子和梯级强度启动子的构建、改造与应用研究。上述研究在Biotechnology Advances, Metabolic Engineering等国际期刊发表SCI收录论文17篇，中文期刊论文3篇。申请中国发明专利11项，其中已授权7项。发表中英文专著章节各1章。培养博士后1人，培养研究生7人（其中博士3人，硕士4人）。在成果转化方面也取得了丰硕成果。2018年以来签订企业合作合同11项，总合同额约2800万元。重组红球菌细胞催化生产丙烯酰胺过程中，实现副产物丙烯酸完全为0，水合反应出料的丙烯酰胺溶液电导率可降低至 5~15 μS/cm，可省去精制工段，经济、环保和社会效益显著。