Nox4介导ROS生成在心肌缺血性损伤中的双刃剑作用及其机制研究

活性氧族及其介导的氧化应激是心脏缺血再灌注损伤的重要机制之一。然而，活性氧族的来源及调控机制尚不明确，且目前抗氧化治疗的临床试验结果并不理想。NAD(P)H氧化酶(Nox）作为心血管系统介导活性氧族生成的主要酶系之一，其介导的氧化应激对缺血再灌注心脏的影响及各亚型参与的应激机制所知甚少。我们在预实验基础上首次提出"Nox4在心肌缺血性损伤中的双刃剑作用"这一假说，拟利用心肌特异性Nox4过表达与显性缺失突变型动物模型,结合在体动物、整体器官和体外细胞不同水平的研究，运用药理学方法和基因干预手段，研究Nox4介导的活性氧族生成在心脏缺血再灌注损伤形成过程中的作用，并着力探讨内源性Nox4在抗缺血再灌注损伤的心脏保护中的意义及其机制。本研究可望对Nox4在心血管系统中的生理病理意义提供全新认识，为心脏缺血性疾病的内源性保护机制作出理论完善，从而为临床上的有效防治及抗氧化治疗提供新的策略和靶点。

冠心病心肌缺血引发的心肌损伤是心衰和心血管源性死亡的主要诱发因素。阐明心肌缺血再灌注(MI/R)损伤机制及保护策略是心血管领域中亟待解决的关键科学问题。NAD(P)H氧化酶是心血管系统介导活性氧族生成及氧化应激的主要酶系之一，其在心肌细胞中主要以Nox2和Nox4两种亚型存在，其中Nox4在心肌缺血性疾病中的作用研究尚属空白。我们在前期预实验中发现Nox4表达上调可加重MI/R损伤, 而内源性Nox4功能的丧失又使心肌损伤程度进一步扩大。这一有趣的发现提示，Nox4来源的活性氧族在MI/R氧化应激损伤中发挥重要作用，而内源性Nox4在抗MI/R损伤的自我保护机制中可能扮演着关键角色。据此，本课题拟从“Nox4在心肌缺血性损伤的双刃剑作用”这一全新角度，从在体动物、整体器官、体外细胞三个不同水平，研究Nox4介导的活性氧族生成在MI/R损伤形成过程中的作用及内源性Nox4在抗MI/R损伤的心肌保护中的意义及其机制。.本课题主要发现如下：⑴Tg-Nox4和DN-Nox4小鼠较对照组MI/R后心功能障碍更明显，梗死面积进一步扩大，心肌细胞凋亡明显增加；⑵ Nox4过表达使心肌细胞维持相对氧化状态，而Nox4功能抑制则造成相对还原状态。化学模拟缺氧时，WT与Tg-Nox4心肌细胞线粒体ROS生成及NADH消耗减少，而DN-Nox4心肌细胞线粒体ROS生成及NADH消耗增加，提示DN-Nox4线粒体功能损伤严重。Nox4活性变化不影响HIF1α的活性及其下游代谢调节信号。⑶ Nox4在成年大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）中高表达，缺氧复氧（H/R）后显著上调，其表达量显著高于Nox2。抑制Nox4表达可显著减少H/R 后ROS 生成，但CMECs存活明显降低，凋亡升高，迁移及成管能力明显减弱；而抑制Nox2对CMECs H/R后存活、凋亡、细胞迁移和成管无明显影响。⑷Nox4调节CMECs HIF1α和VEGF表达，脯氨酸羟化酶（PHD）竞争性抑制剂DMOG可在H/R中抵消Nox4抑制所致的CMECs损伤，阐明“Nox4-PHD2-HIF1α-VEGF”这一信号保护通路。.本研究为Nox4的心血管效应及心脏缺血性疾病的内源保护机制提供了全新认识，为临床心血管疾病抗氧化治疗向ROS来源特异性靶向及调控途径特异性靶向治疗的转变提供了理论和实践依据。