HBx蛋白调控肝细胞癌SNAI1基因转录的机制研究

肝癌细胞发生上皮间叶表型转化（EMT）是其增强侵袭转移能力的重要途径。我们前期发现，HBx蛋白可诱导肝癌细胞Snail1（EMT介导关键因子）过表达，促进其侵袭转移，但HBx对Snail1的调控机制尚不明确。我们观察了HBx对SNAI1基因转录活性的影响，发现HBx对SNAI1启动子的活性调控区段定位于-869~-514。生物信息学预测比对发现，该区段独有c-myc、n-myc结合位点，而此两者正是HBx的靶基因。由此我们推测:HBx通过激活c-myc/n-myc，上调SNAI1基因转录，诱导Snail1过表达，介导肝癌细胞EMT。为验证上述设想，我们拟从HBx对SNAI1转录调节入手，采用启动子活性检测、ChIP、基因转染、RNAi等技术，深入研究HBx对SNAI1基因的调控机制。本研究有望阐明HBx调控肝癌细胞SNAI1基因转录的分子机制，并为HBV相关肝癌的靶向治疗提供理论依据。

肝癌细胞发生上皮间叶表型转化（EMT）是其增强侵袭转移能力的重要途径。我们前期研究发现，HBx蛋白可诱导肝癌细胞Snail1（EMT介导关键因子）过表达，促进其侵袭转移，但HBx对Snail1的调控机制尚不明确。我们初步观察了HBx对SNAI1基因启动子活性的作用，确定HBx对SNAI1基因启动子的活性调控区段定位于-869~-514。生物信息学预测比对分析后发现，该区段c-myc和n-myc结合位点是其独有的。由此我们推测:HBx通过激活c-myc/n-myc，上调SNAI1基因转录，诱导Snail1过表达介导肝癌细胞EMT。.为验证上述设想，我们按照基金申请书的工作计划，循序完成了以下工作。首先，我们构建了完整的SNAI1启动子并进行了截短，明确了HBx蛋白对SNAI1启动子活性具有调节作用，活性区段与前期结果一致。接下来，我们采用定点突变技术，构建了上C-myc和N-myc结合位点突变SNAI1启动子，观察到：在HBx蛋白作用下,突变启动子较野生型活性下降，HBX对SNAI1的转录调控受到抑制,由此明确了C-myc，N-myc在HBX调控SNAI1启动子活性中的关键作用。为进一步验证，我们筛选鉴定了C-myc，N-myc表达确实的shC-myc HepG2和shN-myc HepG2细胞株。以HBx腺病毒感染shC-myc HepG2和shN-myc HepG2细胞后，与野生型相比，snail1在mRNA、蛋白表达均无明显改变，Snail启动子活性变化也没有改变。说明，在C-myc和N-myc表达缺失的HepG2细胞株中，HBx失去了对SNAI1基因转录表达的调控作用，证明HBx通过C-myc和N-myc蛋白实现对SNAI1基因的调控。最后，我们对调控信号通路进行了验证。利用LY294002抑制P13K/Akt通路，未观察到HBx蛋白对HepG2细胞的Snail1及E-cadherin、Vimentin对mRNA转录、蛋白表达产生具有统计学意义的影响，同时HBx也未能发挥与前期实验相似的促进HepG2细胞侵袭能力的作用。而在LY294002作用下，SNAI1基因启动子的活性较对照组明显下降。以上证实，HBx通过P13K/Akt信号通路，作用于SNAI1基因启动子N-myc和C-myc信号位点，实现对snail1蛋白表达的调控作用。