肝细胞癌中HBx调控DNMTs影响抑癌基因表达的机制研究

乙肝病毒（HBV）感染是我国肝细胞癌（HCC）发生的主要病因，其致癌机制尚未阐明。近年包括我们研究结果提示，表观遗传调控在肝癌发生中可能起关键作用。我们曾对肝癌病例研究发现DNA甲基转移酶（DNMTs）在肝癌中异常表达与HBV感染有关；抑制DNMTs诱导了多个重要肿瘤抑制基因（TSGs）的表达并影响肿瘤细胞增殖。为进一步探讨HBx可能调控DNMTs影响抑癌基因表达、功能的表观遗传机制，我们以HBV关键基因HBx转染肝癌细胞系，发现HBx诱导DNMTs调控了CDH1等抑癌基因的表达，提示HBx通过DNMTs相关的表遗传修饰作用调控抑癌基因可能是其致癌的重要途径之一。本项目拟在此研究基础上，分析HBx全长及HBx-COOH截短蛋白调控关键抑癌基因的表观遗传途径，结合HBx可控脉冲转染、ChIP-on-Chip、ChIP、RNAi等方法，深入探讨HBx-DNMTs-TSGs途径和相互作用的蛋白。

乙肝病毒（(Hepatitis B virus, HBV）的慢性感染为我国肝癌的主要病因。有关HBV 致癌机制的研究，一直是肝癌病因的研究热点，但其致癌机制尚未阐明。近年包括我们的研究结果提示，表观遗传调控在肝癌发生中可能起关键作用。我们曾对肝癌病例研究发现DNA甲基转移酶（DNMTs）在肝癌中异常表达与HBV感染有关；抑制DNMTs诱导了多个重要肿瘤抑制基因（TSGs）的表达并影响肿瘤细胞增殖。 为进一步探讨HBx可能调控DNMTs影响抑癌基因表达、功能的表观遗传机制，我们以HBV关键基因HBx转染肝癌细胞系，发现HBx诱导DNMTs调控了E-cadherin, RIZ1,p16等抑癌基因的表达，提示HBx通过DNMTs相关的表遗传修饰作用调控抑癌基因可能是其致癌的重要途径之一。本研究在以往研究的基础上，进一步应用ChIP、IP、RNAi、Chip、BGS 等方法在肝癌细胞系、肝癌病例组织及裸鼠模型上研究HBx通过DNMTs调控抑癌基因表达，影响肝癌的发生发展。 我们的研究发现，HBx通过上调DNMT1 而使E-cadherin、RIZ1等基因启动子区甲基化，从而沉默了这些抑癌基因的表达，诱发了肝癌形成。HBx上调了DNMT3B，同时抑癌基因MTSS1的表达下调。通过DNA甲基化分析，未发现DNMT3B的转入引起MTSS1启动子区高甲基化。应用以DNMT3B 为抗体进行ChIP 分析，发现DNMT3B 与MTSS1 启动子区-645bp～-864bp 区域结合。HBx可能通过DNMT3B结合于MTSS1 启动子区而转录抑制了MTSS1 的表达。结果表明，HBx尽管上调了DNMTs，其对抑癌基因的表达除了DNA甲基化作用之外，不依赖于DNMTs的DNA 甲基催化作用的调控方在肿瘤抑制基因的失活中也起到了重要的作用。 HBx除了上调了DNMTs的表达，同时也影响了组蛋白修饰相关蛋白的表达。 HBx的导入下调了组蛋白甲基化酶RIZ1。转染HBx之后，组蛋白去乙酰化酶HDAC家族成员HDAC2、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、HDAC10出现了程度不同的表达下调，提示HBx能通过调控HDAC家族的表达作用其下游靶基因。此结果提示，肝癌的发生发展中HBx影响了组蛋白修饰相关分子的表达，从而可能调控抑癌基因的表达。此外，我们对HBx转染肝永生化细胞的miRNA