登革热患者尿液标本中诊断标志物的发现研究

Dengue virus (DENV) infections can result in dengue fever and severe dengue in the form of dengue hemorrhagic fever. Currently, only blood samples are used in laboratory diagnosis for dengue, and the diagnosis markers include viral genome RNAs, NS1 antigen and dengue specific antibodies. Recently, we found that DENV genome RNA was shedding in urine samples from dengue patients, indicating potential application in laboratory diagnosis for dengue. In this study, cohort of patients classi?ed according to secondary infection or the severity of dengue disease will be recruited in collaboration with Guangzhou 8th People's Hospital, and both blood and urine samples from each patients will be daily collected during the period of hospitalization. Then, the molecular markers will be detected in all urine samples, including DENV RNA load, NS1 antigen and the level of IgG/IgM antibodies, and kinetics of these markers will be carefully investigated. Secondly, all the results from urine routine examinations, electrolyte and biochemistry parameters from all dengue patients will be carefully collected and organized into a database. Finally, the correlation between specific factors and the severity of disease will be determined using multiple logistic regression analysis. Our project will clarify kinetics of the potential diagnosis markers in urine sample from different patient groups, and reveal the applications for the diagnosis of dengue. Our project will provide a noninvasiveness and rapid diagnostic tool for the post-of-care test of DENV infection, and is of highly importance for prevention and control of dengue epidemic and family diagnosis for dengue.

登革病毒感染可引起登革热和严重的登革出血热。目前登革热的实验室诊断主要依赖血液标本，检测病毒核酸、抗原和特异抗体等诊断标志物的水平。最近，我们发现登革热患者尿液标本中存在病毒基因组RNA，具有潜在的临床诊断价值。在此基础上，本研究将与广州医学院附属市八人民医院联合建立我国初次感染和二次感染，以及登革热和重症登革热患者队列。连续采集患者发热后不同时间的尿液标本，利用实时RT-PCR、ELISA和免疫层析法，分析尿液中病毒RNA载量、NS1抗原和IgG/IgM抗体水平，明确其动力学特征，确定检测窗口期。结合尿液标本的常规和生化检查，建立完整的尿液标本数据库，采用多重logistic回归分析等统计学方法，揭示尿液标本中与重症登革热相关的风险因素。该课题的完成将能阐明不同患者尿液标本中潜在的登革诊断标志物的动力学分布，及其在登革热临床诊断中的价值，为登革热的床旁诊断提供一种无创、快速的检测手段。

登革病毒感染可引起登革热和严重的登革出血热。目前登革热的实验室诊断主要依赖血液标本，检测病毒核酸、抗原和特异抗体等诊断标志物的水平。本项目旨在发现患者尿液标本中潜在的登革诊断标志物，确定其在临床诊断中的价值，为登革热的床旁诊断提供一种无创、快速的检测手段。我们首先采用real-time RT-PCR法对57例登革热患者（登革热患者42例，重症患者15例）的158份尿液标本和73份血浆标本进行登革病毒特异的核酸片段的检测。发现尿液中登革病毒核酸的检测窗口期较血清延迟，但持续时间较长，表明尿液中核酸的存在可作为恢复期登革热患者的重要诊断指标之一。同时，我们采用登革IgA快速检测试剂盒对78名登革热患者（登革热患者53例，重症患者25例）的262份尿液标本进行了登革病毒特异性IgA抗体的检测。我们发现在登革热患者尿液中可检测到登革病毒特异性IgA抗体。在普通登革热患者尿液中，IgA抗体可持续存在于发病的第2-13天，而在重症登革热患者尿液中于发病14天仍能检测到IgA抗体。此外，二次感染患者的尿液标本中，IgA的检测阳性率显著高于初次感染患者。重要的是，在发病4-7天，重症患者尿液中IgA抗体的检出率显著高于普通患者，而且，在恢复期，重症患者尿液中IgA抗体的信号强度显著强于普通患者。以上结果表明，尿液中存在的IgA抗体可能是重症登革热的危险因子，IgA的检测对于指导登革热的临床治疗具有重要意义。此外，对2014年登革热大流行的病原学进行了研究，我们将分离获得的12株2014年登革1型病毒流行株进行系统进化分析，发现这些分离株分属于基因I型和V型，与2013年的广州流行株高度同源，提示我们登革病毒在我国已经形成了地方性流行，对登革热的流行病学监测和媒介控制应该得到更进一步的重视。同时，对2014年登革热患者资料进行了回顾性分析，确定了我国成人重症登革热的预警因子包括血小板、白蛋白下降，以及乳酸脱氢酶升高。这为我国重症登革热的早期预警及综合防治提供了重要依据，对于完善WHO登革热诊疗指南亦具有重要意义。