哮喘中Notch1对T细胞分化作用的调控研究

Notch信号在T细胞发育、活化和分化中发挥重要作用，但确切机制尚不完全明确。我们前期研究发现哮喘小鼠肺T细胞Notch1受体在转录和蛋白表达水平存在异常，但在哮喘病人中却未发现与哮喘相关的Notch1 单个核苷酸多态性位点,推测Notch的调控因子可能在哮喘中也存在异常。本项目拟对哮喘小鼠肺T细胞进行以下研究:分别采用siRNA干扰和质粒转染基因过表达方法,研究Notch受体胞外区主要调控因子Fringe对Notch1调控T细胞分化的影响; 研究哮喘小鼠Notch1乙酰化和甲基化改变对Notch1的T细胞分化作用的影响，包括Notch1 启动子区组蛋白乙酰化水平检测、乙酰化位点鉴定、干扰Notch1乙酰化水平对T细胞分化的影响；检测Notch1甲基化水平,以及甲基化位点鉴定。上述研究可望明确Notch信号通路在哮喘发病机制中的作用，为寻求哮喘治疗新靶点提供理论和实验基础。

卵清蛋白OVA致敏并激发建立哮喘大鼠模型,磁珠分离肺组织CD4+T淋巴细胞。研究发现：（1）哮喘大鼠肺CD4+T淋巴细胞Rfng的表达较对照组升高，Lfng和Mfng的表达较对照组降低。（2）分别转染Rfng基因SiRNA，Lfng和Mfng过表达质粒，与未干预组比较，CD4+T细胞及培养上清中IL-4、IL-5表达降低，IL-12和IFN-γ表达升高。可溶性Jagged1 Fc与CD4+T淋巴细胞共培养，转染Lfng后Th2细胞因子减少。（3）在Jurkat细胞株中，Lfng可以激活Delta1-Notch通路，对Jagged1-Notch通路无作用；在哮喘CD4+T淋巴细胞中Notch信号较对照组明显激活，而Lfng过表达降低了Notch信号通路的传导。Notch信号下游靶基因Hes-1的表达在哮喘CD4+T淋巴细胞中也明显升高，在Lfng过表达后Hes-1表达降低，并且Th2细胞因子减少，Th1细胞因子增多。γ促分泌酶抑制剂阻断Notch信号后，Lfng无明显调节CD4+T细胞分化的作用。（4）DNA甲基化特异性PCR检测哮喘大鼠肺CD4+T细胞Notch1甲基化水平为10%，正常对照组甲基化水平为60%。（4）Notch1基因启动子区-7，-6两个位点去甲基化率明显高于正常对照组。其中-7位点甲基化率正常对组为40%，哮喘组为0；-6位点甲基化率正常对照组为30%，哮喘组为0。（5）与对照组相比，哮喘CD4+T细胞Notch1基因启动子区H3ac、H4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27ac、H3K18ac、H4K16ac、H3K79me3表达水平明显增高，H3K9me3、H4K20me3表达水平无明显差异。（6）GAR干预哮喘肺CD4+T细胞, HAT活性明显下降， Notch1,HES-1和NF-KB的表达降低； Notch1基因启动子区H3ac、H4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K27ac、H3K18ac、H4K16ac、 H3K9me3水平降低（P<0.05），H3K4me3、H3K79me3、H4K20me3水平无明显差异。GAR干预哮喘肺CD4+T细胞， IL-4， IL-5 ，IL-13表达增加，IFN-γ表达降低。