哮喘中T细胞活化衔接子对调节性T细胞调控研究

T细胞活化衔接子（LAT）在调控调节性T细胞（Treg）中发挥关键作用。LAT基因敲除研究显示LAT通过磷酸脂酶C（PLC）-γ1调控Treg。但哮喘自然发病状态下LAT- PLC-γ1通路对Treg的调控尚不清楚。本项目拟以LAT和PLC-γ1特异性 siRNA，分别干扰哮喘小鼠肺CD4+T细胞的LAT和PLC-γ1基因表达，测定PLC-γ1活性，Treg 抑制功能、FoxP3表达和细胞因子分泌；检测LAT表观遗传改变对Treg功能影响。在活体哮喘小鼠检测LAT表达质粒转染对小鼠胸腺和肺Treg的功能影响。并进一步探讨哮喘时LAT- PLC-γ1通路在Treg向Th2细胞转化的分子机制。本课题将从新的视觉研究哮喘发病机制，为哮喘防治提供新靶点。

用卵清蛋白成功建立哮喘小鼠模型，磁珠分离小鼠肺组织CD4+ T淋巴细胞。研究发现：（1) 哮喘组小鼠肺CD4+T淋巴细胞中Th2细胞比例增高，Th1和Treg细胞比例降低，LAT mRNA和蛋白表达降低。PLC-γ1 mRNA和蛋白表达与对照组无明显差异，而p-PLC-γ1较对照组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。（2）体外成功诱导Th2细胞分化，Th2分化细胞中p-PLC-γ1明显降低，且IL-4诱导的分化过程与HDAC1引起的组蛋白乙酰化和Ras/MAPK信号通路相关；（3）SiRNA分别干扰LAT和PLC-γ后可见Th2细胞相关基因的表达增加，Th1相关基因的表达略有降低。（4）LAT和PLC-γ1过表达质粒分别转染CD4+T淋巴细胞后，与对照组相比，Th2细胞比例略有降低，Treg细胞转录因子foxp3增加明显。(5）哮喘组LAT基因mRNA表达较对照组下调51.29%，蛋白表达亦有明显下降（P<0.01）；哮喘小鼠肺组织T细胞LAT基因启动子区H3、H4乙酰化水平较正常对照组低（P< 0.05），而H3K9甲基化水平较正常对照组高（P<0.001）。（6）哮喘小鼠肺T细胞HDAC1蛋白表达水平均较正常组低（P<0.01）；哮喘小鼠T细胞整体组蛋白H3、H4乙酰化和H3K9二甲基化水平较正常对照组无明显差异。（7）哮喘组小鼠肺T细胞受TSA干预后，HDACs活性下降，HDAC1蛋白表达下降；LAT基因mRNA表达较对照组上调55.39%，蛋白表达上升（P<0.01）；LAT基因启动子区H3、H4乙酰化水平较对照组升高，而H3K9甲基化水平无明显改变；培养上清中TSA干预组与对照组比较IL-4浓度降低、γ-IFN浓度增加，分别(15.585±7.523 vs 3.955±2.367) (P<0.01)和(19.075±2.818 vs 33.883±5.527) (P<0.01)。（8）滴鼻法在小鼠活体内过表达LAT质粒后，小鼠肺部Treg细胞比例增加，Treg相关因子（IL-10,TGF-β和Foxp3）mRNA表达增加，Treg相关因子（IL-10和TGF-β）蛋白表达增加（**P<0.01）。