小鼠Treg细胞“默认性”生成诱导移植免疫耐受的作用及其机制研究

寻找有效的途径诱导切实有效的免疫耐受一直是移植免疫的难点和关键。新生期被认为是诱导免疫耐受的时间窗，而调节性T细胞（Treg）在维持自身免疫耐受和移植耐受中起重要作用。申请者首次证实新生小鼠Treg细胞具有"默认性"生成特性，其生成并不依赖外源性TGF-β，而这种特性有助于新生期移植免疫耐受的建立，但其参与免疫耐受的具体机制还不清楚。本研究利用免疫学、分子生物学、细胞学等技术，从细胞因子和Foxp3表达调控方面探究成年与新生小鼠Treg细胞生成特性差异的可能机制，通过CD4基因敲除小鼠心脏移植模型，探明新生小鼠Treg细胞"默认性"生成特性对诱导移植耐受作用及其机制；并探讨联合抑制DNA甲基化转移酶和IL-4信号恢复成年小鼠Treg细胞的"默认性"生成对诱导移植耐受的作用。所得结果将明确Treg细胞在移植耐受诱导中的关键作用及其机制，为有效诱导长期的移植免疫耐受提供实验依据。

基本完成该项目的研究计划目标，因阻断IL-4信号（通过IL-4KO小鼠和IL-4中和抗体）体内不明显改变体内Treg细胞比例，无明显延长心脏移植物存活时间，因此没有必要再进一步联合IL-4抗体和5-AZA（DNA甲基化转移酶抑制剂）干预。. 前期基础研究发现新生小鼠的Treg细胞具有默认性生成特性，该项目中，我们进一步证实新生Treg细胞（NeoTreg）具有nTreg细胞的特征性表面标志（GITR、CTLA-4和Helios），体外具有与nTreg同样抑制功能和稳定性，通过在Rag2-/-心脏移植模型中过继性输注neoTreg细胞证实NeoTreg细胞可缓解移植排斥反应，延长心脏移植物存活时间。进一步研究NeoTreg默认性生成的潜在机制，发现新生小鼠CD4+T细胞接受TCR刺激时表现DNMT1和DNMT3b低反应性使neoTreg细胞Foxp3的CNS2维持低甲基化水平，从而保证neoTreg具有与nTreg相似的抑制功能。5-AZA是一种DNA甲基化转移酶移植，可以抑制DNMT1,3b活性，使CNS2区的保持低甲基化，5-AZA干预可诱导成年小鼠Treg细胞生成，并维持Foxp3体内表达的稳定性，且 5-AZA诱导的Treg细胞具有抑制功能，体内实验证实可明显延长心脏移植物存活时间。Treg细胞生成受多种细胞因子调节，IL-4可显著抑制Treg细胞生成，而体外阻断IL-4可影响成年小鼠Treg细胞生成，进一步研究发现内源性IL-4是抑制成年小鼠Treg细胞生成的因素之一，此内源性IL-4可能来源于NKT细胞活化后分泌IL-4，IL-4基因敲出成年小鼠体外刺激后生成较高比例Treg细胞，而体内Treg细胞比例在IL-4基因敲出小鼠、体内注射IL-4中和抗体等均与野生型小鼠并无差别，IL-4中和抗体干预并不能延长心脏移植存活时间。