smDCs在小鼠ESCs来源的肝细胞移植中诱导免疫耐受及其作用机制

我们前期诱导小鼠胚胎干细胞（ESCs）分化为高纯度肝细胞并将其成功用于同系移植，但阻碍其临床应用的移植排斥问题尚未解决。半成熟树突状细胞（smDCs）是一类新型的耐受性DCs，可通过诱导、扩增调节性T细胞（Tregs）而在自身免疫耐受中发挥重要作用。我们最近发现smDCs可致小鼠皮肤移植耐受，并可减轻ESCs源性肝细胞移植的免疫损伤，提示其对后者亦有可能诱导耐受，但进一步的具体效果及机制不明。为此，本课题拟设计下列内容：①应用smDCs诱导小鼠ESCs来源的肝细胞移植耐受；②验证smDCs通过诱导、扩增CD4+CD25+Foxp3+Tregs而致耐受的作用方式；③阐明其中的MHCⅡ和CD40、CD80、CD86共刺激分子机制以及IL-10、TGF-β等细胞因子机制。本课题旨在探索一种新的耐受诱导方法及其机制，为促进ESCs来源的肝细胞移植应用和耐受理论更新提供研究基础。

首先，对未成熟DC（imDC）、半成熟DC（smDC）、成熟DC（mDC）进一步鉴定，发现smDC体积介于imDC和mDC之间，以圆形与类圆形为主多为类圆形，少数为不规则形。imDC树突细小，多在5-10μm，mDC的树突多长于10μm。通过FCM及ELISA检测发现，smDC分化类型介于imDC和mDC之间，中等水平表达MHCⅡ和CD40、CD80、CD86 共刺激分子，中量分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β，炎性细胞因IL-1β和IL-6等则低水平分泌。然后，建立小鼠ESCs来源的肝细胞移植排斥模型，通过smDC预先输注受体成功诱导模型免疫耐受。发现供体smDC可明显减轻移植细胞在受体内的免疫损伤，同时检测受体小鼠脾脏和血液中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比率明显增多，由3.6％上升至12.1％；体外将smDC与CD4+CD25-T 细胞共培育，发现CD4+CD25+Foxp3+T细胞比率由21.1％上升到39.0％，证实smDC诱导耐受与CD4+CD25+Foxp3+Tregs相关。进一步实验中，阻断MHC-II (I-Ab)、CD40、CD80、CD86，中和IL-10、TGF-β，则可观察到体内CD4+CD25+Foxp3+T 细胞数量减少至1.1%左右，提示smDC通过MHCⅡ和CD40、CD80 、CD86共刺激分子以及IL-10、TGF-β细胞因子来激活上调Treg。另外，对其他文献中提及的调节性树突状细胞（regDC）进行形态学、分子表型和细胞因子鉴定，发现其与smDC类似，regDCs与小鼠ESC分化细胞共培养后亦可减轻其移植免疫损伤，因此推测二者为同一类型细胞。最后，经过上述体内、外实验，综合阐明了smDC在小鼠ESC来源的肝细胞移植中诱导耐受的Treg作用方式及其共刺激分子、细胞因子机制。