环腺苷酸对绵羊卵丘-卵母细胞间隙连接交流的调控机制

Cyclin AMP（cAMP）and gap junctions are two key factors in regulating animal oocyte maturation. In order to clarify the possible mechanism of cAMP regulating Gap junctional communication (GJC) between cumulus cell and oocyte, in this study, ovine cumulus-oocyte complex (COC) will be chosen to creat two kinds of COC models with different cAMP level in oocytes and COCs by adoping several cAMP regulators. Then multiple techniques, including a novel parrafin-section improving methods based on multiple COCs, RT-qPCR, Western blot, GJC and nucleus maturation detection means, and so on, will be integrated to resolve the questions as follows, protein localization of Cx37 and Cx43 in ovine COC; the possible regulation mechanism of cAMP on Cx37 expression and action in oocytes, and the possible effects of cAMP on Cx37 and Cx43 expression and GJC function in cumulus cells. This result are of great significance to further clarify the mechanism of ovine oocyte maturation and to promote the oocyte utilization in vitro.

环腺苷酸与间隙连接是影响动物卵母细胞成熟质量的两种关键因素。为了明确环腺苷酸对卵丘-卵母细胞间隙连接交流可能的调控机制，本研究以绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COC）为研究对象，综合多种能特异调节卵母细胞或者COC中cAMP水平的调节剂，构建两类绵羊COC模型（卵母细胞-cAMP与COC-cAMP），利用一种基于绵羊COCs类组织的新型石蜡切片改进技术，结合多种免疫荧光染色、实时定量PCR、Western Blot、间隙链接功能以及核成熟检测手段，系统探讨：Cx37与Cx43在绵羊COC中的免疫定位; cAMP对卵母细胞内Cx37表达与功能的影响及其可能的调控机制，以及cAMP对卵丘细胞中Cx37与Cx43表达与间隙连接功能的可能影响。本研究结果对于进一步阐明绵羊卵母细胞成熟机理与提升卵母细胞体外利用率，具有重要意义。

环腺苷酸与间隙连接通道是影响动物卵母细胞成熟质量的两类关键信号。为了明确韩腺苷酸对绵羊卵丘与卵母细胞间隙连接交流可能的调控机制，本研究构建了一种基于绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COC）类组织的新型石蜡切片技术，综合多种免疫荧光、实时定量PCR、蛋白电泳、间隙连接功能以及核成熟检测等手段，系统探讨了环磷酸腺苷（cAMP）对绵羊COC中间隙连接蛋白Cx37与Cx43表达以及间隙连接功能的调节机制，研究了cAMP参与E2-ERs调节绵羊卵母细胞减数分裂进程的作用机理。结果显示，体外成熟培养过程中，绵羊COC中cAMP含量出现两次峰值，第一次升高所造成的间隙连接蛋白磷酸化效应，可能是促性腺激素阻止卵母细胞内cAMP外流的一种保护机制；cAMP通过激活PKA通路促进绵羊COC中普遍存在的Cx37与仅存在于卵丘层的Cx43的表达，其机制在于cAMP可以通过基因组与非基因组两种途径实现对间隙连接蛋白表达与功能变化的调节；虽然间隙连接蛋白的磷酸化与总蛋白表达均受cAMP上调，但被增强的卵丘与卵母细胞间间隙连接功能源于cAMP对通道蛋白表达更为强烈的正向调节；低水平E2（0.5ng/mL）通过提升绵羊COC中cAMP水平，激活PKA通路，上调ERβ，维持绵羊卵母细胞减数分裂停滞。本研究结果对于深入了解绵羊卵母细胞成熟机理以及促进体外成熟卵子的生产利用率，具有重要意义。