uPA和uPAR参与牛卵丘细胞和体外成熟卵母细胞对话的作用研究

Urokinase-type plasminogen activator (uPA) can combine with its receptor (uPAR) to transfer the extracellular signals into cells regulating their nomal life activities. The purpose of this project is to investigate the specific role of uPA / uPAR in bovine cumulus - oocyte complexes (COCs) in vitro maturation. In this study, the co-cultured experimental model of bovine denuded oocytes and cumulus cells is established, and many methods are adopted, such as, uPA activity analysis, real-time quantitative RT-PCR and Western-blot, combined with a variety of the nucleus and cytoplasm maturation testing means, to study the interaction between uPA / uPAR, hormone(FSH, LH, E2), MAPK signal and several developmental genes (Cox2 / Pentraxin3) in cumulus cell development process, and the possible regulation of uPA / uPAR and/or cumulus cells on MAPK signal, some cytoplasm genes (GDF-9 / BMP-15) and other mature events during bovine oocytes in vitro maturation, to reveal the active mechanism of uPA / uPAR in the cross-talk between bovine cumulus and oocytes in vitro maturation, to understand oocyte maturation mechanism and promote in vitro utilization of bovine oocytes.

尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）通过与其受体（uPAR）结合，将胞外信号转入细胞内，参与对细胞正常生命活动的调节。为了探讨uPA/uPAR在牛卵丘-卵母复合体（COCs）体外成熟中的具体作用，本研究通过建立牛裸卵与卵丘细胞共培养实验模型，利用uPA活性分析、实时定量RT-PCR与western蛋白检测等多种技术，结合多种核质成熟检测手段，研究uPA/uPAR与激素（FSH、LH、E2）、MAPK信号、发育基因（Cox2\Pentraxin3）在调节卵丘细胞发育过程中可能的互作模式，以及uPA/uPAR与受其调控的卵丘细胞在卵母细胞成熟进程中与MAPK信号、胞质成熟基因（GDF-9\BMP-15）和其他成熟事件可能的调控关系，以揭示uPA/uPAR参与牛卵丘细胞和体外成熟卵母细胞对话的作用机制，为进一步揭示卵母细胞成熟机理和提高牛卵母细胞体外利用率提供实验支持。

尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）通过结合其受体（uPAR）而被激活后，将胞外信号转入细胞内，参与对细胞正常生命活动的调节。为了探讨uPA在卵泡发育与卵母细胞成熟过程中的可能作用，本研究以体外培养的牛卵丘颗粒细胞、卵丘-卵母细胞复合体（COC）与裸卵为研究对象，利用免疫组化、细胞培养、细胞增殖检测、卵母细胞成熟、地衣红染色、体外受精、酶联免疫以及Western Blot等技术，系统研究了uPA对卵丘颗粒细胞发育以及卵母细胞成熟的具体作用及其涉及的信号机制。研究发现：（1）体外培养的牛卵丘颗粒细胞能同时表达uPA与uPAR；uPA通过结合其受体uPAR，可能有利于细胞越过G2/M期检验点上或中后期检验点，进而促进卵丘颗粒细胞增殖，而与细胞凋亡无关。uPA促进卵丘颗粒细胞增殖的机制在于：uPA通过上调cAMP水平,激活培养细胞ERK与AKT的磷酸化，最终促进了细胞增殖；（2）uPA仅表达于卵丘细胞，而其受体在卵丘细胞与卵母细胞中均有表达，揭示牛卵丘细胞表达的uPA以自分泌与旁分泌途径，分别作用于卵丘与卵母细胞上的uPAR，在牛卵母细胞成熟过程中可能有重要作用；uPA通过促进体外成熟培养中的牛COC与卵母细胞中cAMP积累，阻滞了成熟早期（6h）内卵母细胞减数分裂进程恢复，推测可能通过完善胞质成熟程度，最终提升了卵母细胞的后续胚胎发育能力。综上，本研究首次发现uPAs系统对于牛卵丘颗粒细胞增殖与卵母细胞成熟具有重要调节作用。本研究结果有助于对于牛卵泡发育与卵母细胞成熟机制地深入理解，对于提升牛卵母细胞体外利用率具有实践价值。